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Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
发育生物学

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Published: March 04, 2020
doi:
10.3791/60927
, ,
1Department of Animal Science,Rutgers University

Summary

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Abstract

Quantificar diferenças na abundância de mRNA é uma abordagem clássica para entender o impacto de uma determinada mutação genética na fisiologia celular. No entanto, caracterizar diferenças no traduzome (todo o mRNAs traduzido) fornece uma camada adicional de informações particularmente úteis ao tentar entender a função de proteção ou encadernação de proteínas de RNA. Uma série de métodos para isso foram desenvolvidos, incluindo perfil de ribossome e análise polisome. No entanto, ambos os métodos carregam desafios técnicos significativos e não podem ser aplicados a populações específicas de células dentro de um tecido, a menos que combinados com métodos adicionais de classificação. Em contraste, o método RiboTag é uma alternativa genética, eficiente e tecnicamente simples que permite a identificação de RNAs associados a ribossomos de populações específicas de células sem etapas adicionais de classificação, desde que um driver Cre específico de célula aplicável esteja disponível. Este método consiste em reprodução para gerar os modelos genéticos, coleta de amostras, imunoprecipitação e análises de RNA a jusante. Aqui, esboçamos esse processo em células de germes de camundongos machos adultos mutantes para uma proteína de ligação de RNA necessária para a fertilidade masculina. Atenção especial é dada às considerações para a reprodução com foco no manejo eficiente das colônias e na geração de fundo genético correto e imunoprecipitação, a fim de reduzir o fundo e otimizar a produção. Discussão de opções de solução de problemas, experimentos confirmatórios adicionais e possíveis aplicações a jusante também estão incluídas. As ferramentas genéticas apresentadas e os protocolos moleculares representam uma maneira poderosa de descrever os RNAs associados ao ribossomo de populações específicas de células em tecidos complexos ou em sistemas com armazenamento e tradução de mRNA aberante com o objetivo de informar sobre os condutores moleculares de fenótipos mutantes.

Introduction

A análise da abundância de RNA de uma célula ou tecido, examinada pela micromatriz ou sequenciamento de RNA, provou ser uma ferramenta poderosa para entender os condutores moleculares dos fenótipos mutantes. No entanto, essas ferramentas de análise relativamente incompletas podem não informar sobre a fisiologia ou proteome da célula, especialmente em sistemas onde muitos mRNAs são armazenados antes da tradução, como células neurais e germinativas. Nesses sistemas, definir a população de mRNAs sendo ativamente traduzido em proteína, ou traduzo da célula, pode ser um indicador melhor do estado fisiológico real da célula1,2. Por exemplo, células germinativas em vários estágios de desenvolvimento transcrevem RNAs que são armazenadas para tradução posterior, impulsionadas pelo desenvolvimento3 ou sinalizando pistas4. Esse processo é exemplificado pelas protaminas de codificação de mRNAs, onde a transcrição mRNA é detectável dias antes da proteína ser feita1,2,5,6. Da mesma forma, as células neurais transcrevem o RNA no núcleo e transportam-no pelo axôlo, como é o caso do β-actin7. Além desses sistemas de células especializadas, é improvável que os transcriptomes de estado estável sejam informativos em modelos onde o armazenamento de RNA, biogênese ribossome ou tradução de mRNA são impactados. Vários outros fatores também podem impactar a piscina de RNA de estado estável de uma célula, incluindo a decadência do mRNA e a atividade de proteínas de ligação de RNA. Nesses casos, ferramentas robustas para analisar RNAs ou mRNAs associadas a ribossomos tradução ativa são mais propensas a produzir resultados biologicamente relevantes.

Para isso, vários métodos foram desenvolvidos para identificar mensagens associadas a ribossomos ou ativamente traduzidas. O perfil polisome, que fornece um instantâneo de transcrições associadas ribossomos, tem sido usado por muitas décadas para isolar RNAs intactas associadas a subunidades ribossômicas ou complexos mono, di-e poli-ribossomo3. Resumidamente, os lisatos celulares coletados são aplicados a um gradiente linear de sacarose e centrífugas como alta velocidade, resultando na separação das subunidades ribosanas, ribossomos intactos e polisomes por tamanho. Tradicionalmente, essa técnica tem sido aplicada para estudar um ou alguns mRNAs, mas recentemente este método foi combinado com estudos de RNA-seq para elucidar a função de potenciais reguladores translacionais8,9 Enquanto uma maneira poderosa de diferenciar entre traduzir ativamente e não traduzir mRNAs10,o perfil polisome requer métodos demorados (fração gradiente e ultracentrífuga) e pode exigir uma boa quantidade de amostra a análise celular rara que faz a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise rara da célula fazer a análise celular rara populações desafiadoras.

Uma abordagem alternativa para examinar o traduzome é o perfil ribossome, que identifica as partes das transcrições diretamente associadas ao ribossomo. Em resumo, fragmentos de RNA associados ao ribossomo são gerados através de ensaio snase de proteção, complexos individuais de ribossomo separados via gradiente de sacarose, e fragmentos de RNA associados isolados e convertidos em etiquetas RNA-seq habilitados para sequenciamento profundo11. Um dos principais benefícios para o perfil ribossado é a capacidade de determinar os locais específicos dos ribossomos no momento do isolamento que permite a identificação de locais de início de tradução, cálculo da ocupação e distribuição ribossômicas e identificação de barracas ribossais12. No entanto, este método tem várias desvantagens inerentes, incluindo necessidades de equipamentos (fracionador gradiente e ultracentrífuga), um protocolo relativamente complexo que requer solução de problemas extensos, e problemas computacionais não facilmente tratados pelo usuário inexperiente11. É importante ressaltar que o perfil ribossome é aplicado principalmente a células isoladas na cultura e requer material substancial, tornando sua aplicação a tecidos mistos do tipo celular ou células classificadas do in vivo limited.

O método riboTag mamífero, desenvolvido por Sanz et al. em 200913,elimina uma série de questões inerentes tanto ao perfil polisome quanto ribossome. Neste método, as RNAs associadas ao ribossomo podem ser isoladas de tipos de células específicas que permitem a investigação de traduzomes específicos do tipo celular em tecidos complexos sem técnicas adicionais de isolamento e equipamentos especializados, como é necessário em outros métodos13,14. A base do método RiboTag é um modelo de mouse transgênico (RiboTag) carregando um lócus modificado para o gene de proteína de subunidade ribossômica Rpl22. Este lócus (Rpl22-HA) inclui um exon terminal floxed seguido de uma cópia adicional do exon terminal alterado para incluir uma tag de hemagglutinina terminal C (HA) dentro da região de codificação. Quando atravessado para um rato expressando uma cre recombinaçãose específica de células, o exon floxed é removido permitindo a expressão de RPL22 marcado pelo HA de forma específica para células(Figura 1). A tag HA pode então ser usada para imunoprecipitar (IP) ribossomos e seus RNAs associados do tipo de célula selecionada.

Além da publicação inicial que desenvolveu a técnica, vários outros laboratórios utilizaram o modelo RiboTag. Diversos tecidos como as células De camundongos Sertoli e Leydig15, microglia16, neurônios17,18, oócitos19, e células cultivadas20 foram perfilados e estudados. Embora este protocolo seja claramente capaz de isolar com sucesso ribossomos e os RNAs associados em vários tipos de tecidos, ainda há áreas que precisam de melhorias, especialmente quando aplicadas a sistemas mutantes. Em particular, a dependência comum do tecido fresco resulta em maior variação técnica que pode reduzir consideravelmente o poder da análise. Em segundo lugar, a identificação confiante de alvos traduzidos diferencialmente é mais desafiadora quando o alto fundo de imunoprecipitação ocorre a partir de tipos de célulasnão–Cre recombinadas como relatado anteriormente13. Enquanto Sanz et al. projetaram a premissa básica da técnica, neste manuscrito o laboratório Snyder apresenta otimização do protocolo para reduzir essas preocupações, tornando o método mais prático e eficiente.

A intenção deste artigo é explicar os passos para a reprodução de camundongos que expressam ribossomos com ha específicos de células, imunoprecipitando esses ribossomos de amostras congeladas e purificando seus RNAs associados para análises a jusante. Como a célula de germe macho mamífero e a mutação da infertilidade estudada fornecem desafios únicos, esforços têm sido feitos para iluminar maneiras que essa técnica pode ser adaptada a outros sistemas celulares.

Protocol

Todas as práticas de uso e manuseio de animais foram aprovadas pelo Comitê Interno de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Rutgers (IACUC). 1. Criação de rato Criar camundongos fêmeas homozigosos para uma mutação proteica de ligação de RNA que leva à infertilidade masculina (manuscrito em preparação, referido aqui como o gene de interesse) em acasalamentos de trio para machos hemizygous para a alusão Stra8-iCre (B6). FVB-Tg (Stra8-iCre)1Reb/LguJ)(Cre+), como emparelhar duas fêmeas a cada macho aumenta a eficiência dereprodução.NOTA: O gene mutante de interesse (M) foi aprovado maternalmente, já que as fêmeas homozigosas para M têm fertilidade normal. Isso tem o benefício adicional de permitir a transmissão paterna da célula de germe macho Cre (hemizygous), como recomendado21 e otimizar o percentual de descendentes com a combinação acetélica desejada. Como o Homoziggous Cres exibe toxicidade de células germinativas22,recomenda-se que o alelo seja mantido e passado em um estado heterozigo ou hemizygous. É importante ressaltar que a expressão cre não deve co-ocorrer com a alelo Rpl22-HA até a população experimental. A não isolar o alelo Rpl22-HA de Cre em animais de criação resultará em descendentes que expressam globalmente Rpl22-HA devido à atividade cre das células germinativas. Esta questão é específica para células germinativas. Além disso, o Stra8-iCre é específico para a população celular dos autores de interesse22,direcionando células em transição para e muito cedo na meiose, incluindo preleptotenos e leptotenes. Um driver Cre diferente específico para outro tipo de célula de interesse pode ser usado em vez disso. A prática comum dita que a célula de germes masculinoexpressa Cres seja transmitida no lado paterno. No entanto, é possível que a transmissão materna do Stra8-iCre resultará em expressão transgênica semelhante na prole masculina. Independentemente do esquema de reprodução selecionado, a fim de gerar filhos com expressão Cre equivalente, todas as amostras experimentais devem ser geradas via transmissão cre do mesmo lado parental (sempre maternal ou sempre paternal). Filhotes machos resultantes do genótipo, conforme descrito na seção 2.4. Selecione aqueles que carregam o Alelo M e positivo para Cre (+/M:Cre+) para reprodução a jusante. Raça camundongos fêmeas homozigosos para o M alelos em acasalamentos de trio para machos homozigosos para Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ).NOTA: O fundo Rpl22-HA é altamente misturado, por isso o cuidado deve ser exercido ao avaliar fenótipos específicos da cepa. Filhotes fêmeas do genótipo para identificar aqueles que carregam o alelo M e positivos para Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (ver seção 2.3). Selecione essas fêmeas para a reprodução a jusante. Cruze +/M:Cre+ machos com +/M:Rpl22+ fêmeas em acasalamentos trio. Genótipo dos filhotes resultantes (ver seções 2.3 e 2.4) para identificar machos que são cre+ e Rpl22+ e ou tipo selvagem ou M/M.NOTA: À medida que este trabalho se concentra em uma mutação que resulta em infertilidade masculina completa, considerações especiais foram tomadas no esquema de reprodução para obter genótipos experimentais mais eficientes. Tais considerações podem ser desnecessárias em outros modelos experimentais. Veja a Figura 2 para uma lenda completa de reprodução e acompanhamento para discussão adicional de considerações de reprodução. 2. Coleta de amostras Colete testes de camundongos machos em 21 dias pós-parto (dpp). Ratos de sacrifício por inalação de CO2 seguido de luxação cervical. Faça uma incisão ventral (3 cm) em cada animal ladeado por dois mais curtos (2 cm cada), incisões laterais conectadas. Puxe a pele e o peritôono de volta para revelar os testículos. Usando fórceps, puxe a almofada de gordura epidímica de um lado da cavidade corporal para revelar a epididime e os testículos. Com tesoura de tenotomia, excisse os testículos, tomando cuidado para aparar epididime, gordura circundante e qualquer vasculatura externa. Coloque testes intactos em um tubo limpo de 1,7 mL. Repita com o outro lado, adicionando os segundos testículos ao primeiro tubo. Cubra este tubo e submerga-o imediatamente em nitrogênio líquido para congelar.NOTA: As amostras podem ser preservadas a -80 °C até o uso. Colete amostras adicionais de ponta traseira para cada animal (2 mm) para confirmação de genotipagem. Para extrair DNA, adicione 100 μL de 50 mM NaOH a uma ponta traseira de 2 mm em um tubo de 1,7 mL e ferva a 95 °C por 30 min. Adicione 100 μL de 50 mM HCl e 20 μL de 1 M Tris-HCl pH 8.0 e amostras de centrífuga por 3 min a 10.000 x g. Retenha o supernatant (contendo DNA genômico) e armazene dna extraído a 4 °C até usar como modelo para as seguintes reações genotipadoras. Executar genotipagem Rpl22-HA seguindo um método adaptado de Sanz et al.13 usando os seguintes primers: forward: 5′ GGGAGGCTTGCTGGATG 3′; inverter: 5′ TTTCCAGACACACACAGGCTAAGTACAC 3′. Prepare uma mistura de reação composta por 2 μL de DNA extraído na etapa 2.2.1, 0,08 μL de 25 mM dNTPs, 0,1 μL de 10 mM primer dianteiro, 0,1 μL de 10 mM de primer reverso, 2 μL de um tampão de reação de corrente de polimerase (PCR) (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2, e 0,1% Tween), 0,2 μL de polímerase Taq, e H2O livre de nuclease para um volume total de 20 μL. Use as seguintes condições de termociclo: um passo de fusão de 30 s a 95 °C, 30 s anneal a 64 °C e um alongamento de 30 s a 72 °C, repetido 37 vezes com um alongamento final de 5 min a 72 °C.NOTA: Isso rendeu um tamanho de produto de 260 bp para amostras de tipo selvagem e 292 bp para amostras que eram Rpl22-HA+ Realize a genotipagem Cre usando as seguintes primers: forward: 5′ GTGCCAGCTGAACAACAGGAACAGGA3′; inverter: 5′ AGGGACACAGCATTGGAGTC 3′. Prepare a reação do PCR como descrito na etapa 2.3.2 utilizando os primers Cre em vez disso. Use as seguintes condições de termociclo: um passo de fusão de 30 s a 95 °C, 30 s anneal a 60 °C e um alongamento de 15 s a 72 °C, repetido 35 vezes com um alongamento final de 5 min a 72 °C. Realizar genotipagem genética de interesse como é padrão para o gene em questão.NOTA: O protocolo de genotipagem do autor utiliza um Taqpersonalizado concentrado , e, como tal, outros usuários podem ter que modificar as condições para atender aos seus requisitos enziáticos. Para entender melhor o impacto desse gene de perda de interesse na tradução, machos que eram selvagens ou homozigosos para a aleitamento mutante de interesse e que também eram Cre+ e Rpl22+ foram selecionados para serem as amostras experimentais. A seleção de genótipo é ainda mais discutida acima na seção 1. 3. Preparação de soluções NOTA: A preparação de soluções e todas as etapas subsequentes devem ser feitas condições rigorosas. Para preparar o buffer de homogeneização (HB), adicione 2,5 mL de 1 M Tris pH 7.4, 5 mL de 1 M KCl, 600 μL de 1 M MgCl2, e 500 μL de NP-40 a um tubo de 50 mL. Leve ao volume (50 mL) em pirocarbonato diethyl (DEPC) H2O e misture até que todos os componentes sejam incorporados.NOTA: As concentrações finais serão as seguintes: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2e 1% NP-40. Para preparar o tampão de lavagem de sal alto (HSWB), adicione 2,5 mL de 1 M Tris pH 7.4, 15 mL de 1 M KCl, 600 μL de 1 M MgCl2, e 500 μL de NP-40 a um tubo de 50 mL. Leve ao volume (50 mL) no DEPC H2O e misture até que todos os componentes sejam incorporados.NOTA: As concentrações finais serão as seguintes: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2e 1% NP-40O protocolo pode ser pausado aqui, e as soluções podem ser armazenadas à temperatura ambiente até o uso. 4. Preparação do tecido Prepondere todos os tubos de amostra, registrando peso e pré-cool em nitrogênio líquido. Argamassa estéril pré-fria, pilão e espátula de pesagem no gelo seco. Moer amostras de tecido congelado em um pó fino usando uma argamassa pré-fria e estéril e pilão no gelo seco. Coloque tecido congelado flash em argamassa pré-esfriada no gelo seco. Quebre suavemente o tecido em grandes pedaços usando pilão e triture lentamente até que o tecido esteja em pó fino.NOTA: Embora o tecido fresco também possa ser usado, de acordo com o protocolo original13,não se observa diferença significativa no desfecho com o uso de tecidos congelados. Veja resultados representativos e discussão para obter detalhes. Transfira cuidadosamente a amostra de terra para o tubo de coleta pré-refrigerado raspando pó da argamassa usando espátula pré-refrigerada. Certifique-se de que apenas o tecido é coletado e não qualquer umidade depositada na argamassa fria. Pesar o tubo com tecido, tomando cuidado para manter o gelo seco sempre que possível. Calcule a massa de tecido subtraindo o peso inicial do tubo do peso do tubo com a amostra nele. Registre esse valor para cálculo posterior dos volumes de buffer de lise.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C até o uso. 5. Homogeneização da amostra Prepare o tampão de lise (10 mL HB + suplementos) adicionando 10 μL de 1 M dithiothreitol (DTT), 1 comprimidor inibidor protease, 50 μL de inibidor de RNase (40.000 unidades/mL), 200 μL de cicloheximida de 5 mg/mL e 100 μL de 100 mg/mL heparin a 10 mL de HB. Misture até que todos os componentes sejam incorporados e mantenha no gelo até o uso.NOTA: As concentrações finais dos suplementos em 10 mL HB serão as seguintes: 1 mM DTT, inibidor U/mL RNase, 100 μg/mL cicloheximidde e 1 mg/mL heparina. Esta solução deve ser utilizada dentro de 24 h da adição dos suplementos e pode ser mantida a 4 °C ou no gelo até o uso. Para cada 100 mg de amostra, adicione 1 mL de tampão de lise. Com a mesma pipeta usada para adicionar o tampão de lise, cuidadosamente pipeta o lisato resultante para cima e para baixo para fragmentar células e misturar. Continue a tubulação até que a amostra não seja mais viscosa, geralmente de 25-30 derrames.NOTA: Como a solução é muito viscosa no início, uma pipeta de grande diâmetro deve ser usada para misturar a solução. Um padrão de 1000 μL é normalmente suficiente para 100 mg de tecido. Coloque amostras no gelo por 10 min para lyse. Em seguida, gire amostras em uma centrífuga pré-esfriada (4 °C) por 10 min a 10.000 x g. Uma pelota grande, solta e nublada deve se formar no fundo do tubo. Tomando cuidado para não perturbar a pelota, colete o lysato em um novo tubo e registre o volume para cada amostra. Para evitar a desdatasão amostral, certifique-se de que as amostras permaneçam frias durante todo o protocolo restante, armazenando gelo ou a 4°C sempre que possível. 6. Equilíbrio de contas Usando o volume de lysate a partir da etapa 5.2, calcule o volume necessário de contas magnéticas acopladas à proteína adequada de ligação de anticorpos (neste caso, proteína G). Para 1 mL de lysato, use 375 μL de contas proteicas G (30 mg/mL).NOTA: A escolha das contas conjugadas vai variar com anticorpo anti-HA usado; por exemplo, se um anticorpo anti-HA gerado por coelho for selecionado, as contas de proteína A serão preferíveis. Usando um rack de tubo magnético, remova solvente de contas e adicione um volume igual de tampão de lise fresco às contas. Gire 5 min a 4 °C para lavar. Realize todas as etapas de rotação usando um rotador de tubo de bancada definido a 20 rpm. Coloque o tubo no rack do tubo magnético e remova o tampão de lavagem. Repita os passos 6.1-6.3 mais duas vezes. Adicione o buffer de lise no volume original às contas equilibradas. Guarde a 4 °C ou no gelo até o uso. 7. Amostra de pré-limpeza Adicione 50 μL de contas equilibradas para cada 1 mL de lysato para supernatant de amostra lised (lysate) e gire a 4 °C para 1 h. Coloque o tubo no rack de ímã e cole lysate em um tubo fresco. Descarte contas usadas. Ao lysate adicione 25 μL de contas equilibradas para cada 1 mL e gire a 4 °C por 1 h. Armazenar contas g de proteína equilibrada sem 4 °C durante a noite. Coloque o tubo no rack de ímã e colete lisato em um tubo fresco. Descarte contas usadas. A partir do lisato limpo, retenha 50 μL para atuar como controle de entrada de amostra. Loja a -80 °C.NOTA: A amostra de entrada atua como um controle representando a população total de RNA da amostra, incluindo RNAs associadas a outros tipos de células no tecido, a ser usada durante análises a jusante para corrigir as alterações de expressão genética em função da mutação. 8. Incubação de anticorpos Para cada 1 mL de lysate limpo, adicione 5 μg de anticorpo anti-HA. Para evitar a perda de amostras, seque a tampa do tubo com filme de laboratório. Gire amostras 16-18 h a 4 °C.NOTA: O tempo de incubação e concentração de anticorpos não foram otimizados. Os autores encontraram uma incubação noturna com 5 μg para ser suficiente; no entanto, é possível que uma incubação mais curta ou menos anticorpo seja adequada, ou que uma incubação mais longa ou mais anticorpo melhore a vinculação. 9. Incubação de contas Para cada 1 mL de lisato limpo, adicione 300 μL de contas proteicas G. Resqueie a tampa do tubo com filme de laboratório e gire por 2h a 4 °C. 10. Lavagem de contas Coloque o tubo de amostra no rack de ímã para permitir que as contas se separem do lysato de iped. Pipette fora de lisate de fluxo e descarte, retendo as contas. Aplique 800 μL de HSWB para contas e deixe girar por 10 min a 4 °C. Coloque o tubo de amostra no rack de ímã e deixe as contas se separarem da lavagem. Remova e descarte a lavagem. Aplique mais 800 μL de HSWB para contas. Feche a amostra e deixe girar por 5 min a 4 °C. Coloque o tubo de amostra no rack de ímã e deixe as contas se separarem da lavagem. Remova e descarte a lavagem. Repita o passo 10.3 mais uma vez. 11. Extração de RNA Coloque o tubo de amostra no rack de ímã e deixe as contas se separarem da lavagem. Pipette fora e descartar lavagem, retendo contas para extração de RNA. Adicione 3,5 μL de 14,2 M beta-mercaptoetanol (bME) às contas e misture por vórtice s. Extrair RNA usando um kit de purificação de RNA comercial, de acordo com as instruções do fabricante. Amostra de elute em 30 μL de RNase free H2O.NOTA: Embora o tratamento de DNase de 10 μL/amostra lé seja opcional para a maioria dos kits, ele é fortemente incentivado. Esta etapa opcional de limpeza reduz significativamente o fundo, permitindo uma concentração final mais precisa. É fortemente recommendo usar um kit que contém beta-mercaptoetanol (bME) no buffer de lise. bME atua como um inibidor adicional de RNase para evitar a degradação da amostra durante o isolamento do RNA. Experimente a amostra a -80 °C ou analise imediatamente. 12. Quantificação e análise amostral Usando um espectrômetro UV-Vis, quantifique a concentração de RNA e a qualidade preliminar. Analise a qualidade do RNA extraído de amostras através de um bioanalisador.NOTA: O RNA resultante pode então ser usado para sequenciamento de RNA ou outras análises a jusante, como manchas de norte ou PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR).

Representative Results

Relatórios anteriores sugerem imunoprecipitação não específica de células sem Cre14. Para determinar se esse foi o caso em nosso protocolo modificado, a eficiência ip foi determinada em amostras derivadas de animais que transportam cre e Rpl22-HA e animais que transportavam apenas um, mas não o outro com a expectativa de que, sem um Cre-drivere Rpl22-HA,o RNA imunoprecipitado deve ser mínimo. Como mostrado na Figura 3,muito pouco RNA é isolado de amostras sem Cre ou Rpl22-HA demonstrando a eficácia deste protocolo para reduzir o fundo IP e isolar rnas ribosais com etiquetaHA genuínas ha. Além disso, tanto cre-apenas quanto as amostras Rpl22-HA- representam controles negativos adequados. Dado o potencial de fonte de reagente para impactar significativamente a eficiência do IP, uma série de anticorpos e protocolos de isolamento de RNA foram testados(Figura 4) em amostras positivas cre e Rpl22-HA. Esses resultados demonstram que a seleção de reagentes pode ter um impacto significativo na eficiência ip, portanto, quaisquer alterações na seleção de reagente devem ser feitas com cuidado. A fim de testar este protocolo no contexto de um mutantes de proteína de ligação de RNA, wildtype-Cre+Rpl22-HA+ (tipo selvagem) e gene de interesse-/-Cre+Rpl22-HA+ (Gene de interesse-/-) testes foram examinados para a eficácia do sistema RiboTag para isolar rna associado ao ribosome(Figura 5). Quando a concentração de RNA de entrada de wildtype e IP foi comparada com Gene de interesse-/- entrada e IP, nenhuma diferença significativa foi observada entre genótipos. Para ambos os genótipos, no entanto, a concentração de entrada foi significativamente maior do que a concentração de IP, indicando que havia mais RNA na amostra de entrada (Figura 5B). Esse resultado é esperado, pois nem todos os mRNAs presentes na célula estão associados ao ribossomo a qualquer momento, especialmente no caso de células germinativas onde as RNAs podem ser transcritas muito antes de serem traduzidas. Para confirmar a qualidade das amostras de RNA enviadas para sequenciamento, as amostras foram executadas em um bioanalisador. Os números de integridade do RNA (RINs), normalmente calculados como a razão de picos rRNA 28S e 18S, foram comparados em amostras. No total de piscinas de RNA, espera-se que os valores de RIN sejam próximos de 10 anos com maior rin correlacionado com maior integridade e qualidade da amostra inferida. Enquanto as amostras de IP tinham RIN menor do que as entradas, os RINs ainda estavam dentro de uma faixa aceitável e não dependiam do genótipo amostral(Figura 5C). Os valores reduzidos de RIN para amostras de IPed são provavelmente resultado da degradação do RNA, embora muito menor, dada a diminuição relativamente pequena do comprimento médio do nucleotídeo das RNAs analisadas. Dada a duração do protocolo e as temperaturas necessárias para a imunoprecipitação alguma degradação é esperada. Também é possível que a redução do comprimento de RIN e RNA seja uma função de enriquecimento para espécies não rrna, como mRNAs. Figura 1: O método RiboTag. A premissa do método é biologicamente simples. Um novo Exon 4 é inserido na sequência para o lócus Rpl22 rio abaixo do Exon 4 original. Na presença de um motorista cre, sites loxP em ambos os lados da Exon 4 original são cortados, excidez do exon floxed. O Exon 4 com marca HA está agora incorporado em Rpl22 mRNA, gerando um Ha marcado RPL22 em células expressando CRE. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 2: Esquema de reprodução de amostras para ratos RiboTag. Mostra-se o esquema de reprodução utilizado para gerar animais experimentais. Um esquema de duas pontas foi utilizado. Na geração 1, foram estabelecidos dois conjuntos paralelos de trios de criadores. Um lado combinou a alelo de interesse (transportada maternalmente como essa mutação específica resulta em infertilidade masculina) com o Cre hemizigo e do outro combinando a alelo de interesse, novamente transportada maternalmente, com Rpl22-HA. Então, na geração 2, os machos do primeiro par que carregam o alelo de interesse e o Cre são cruzados para descendentes femininos do segundo par que carregam a alelo de interesse e Rpl22-HA. Os genótipos da prole resultante são determinados, e animais experimentalmente relevantes selecionados (neste caso, ou selvagem ou mutante homozigoso carregando tanto os alelos Cre quanto Rpl22-HA). É importante notar que as células germinativas expressando os condutores cre,os alelos Cre e Rpl22-HA não devem ser reunidos até a geração experimental. A exposição da alelo Rpl22-HA a Cre expressa por células germinativas em gerações de reprodução impulsionará a excisão Rpl22-HA de células germinativas. Qualquer descendente resultante expressará globalmente Rpl22-HA, evitando assim o isolamento ribossome específico para células. No sistema descrito aqui, um n = 4 por genótipo forneceu energia estatística suficiente para análises a jusante. O número de replicação biológica deve ser determinado para cada sistema experimental. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 3: Confirmação de controles negativos. Amostras que são Cre+ e Rpl22-HA+ mostram maior retração de RNA do que amostras que são apenas Cre+ ou Rpl22-HA+. Não há diferença significativa entre a eficácia de retirada de RNA amostra Cre+ e Rpl22-HA+, indicando que as amostras sem o Cre ou o Rpl22-HA são controles negativos adequados. Um “+” indica que o alelo ou transgene correspondente estava presente nessas amostras e um “-” denota sua ausência. Ip/input representa a razão de RNA imunoprecipitado (IP) sobre o RNA total (entrada). Valor calculado a partir da concentração em nanogramas. ** indica p < 0025. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 4: Reagentes impactam o sucesso do protocolo. (A)O tecido congelado flash resulta em eficiência imunoprecipitação semelhante à do tecido fresco. (B) foi determinada eficiência IP para dois anticorpos comerciais, designadas como Anticorpo 1 e Anticorpo 2 (Tabela de Materiais). Quando testado, Antibody 1 foi mais eficiente em retirar rna do que Antibody 2, que parecia ser incapaz de diferenciar entre negativo (não expressando cre ou Rpl22-HA+) e controles positivos (expressando tanto Cre quanto Rpl22-HA+). Os pontilhões indicam a razão do IPed versus RNA de entrada para réplicas biológicas individuais. (C) Quando os kits de extração de RNA (Tabela de Materiais) foram comparados, o Kit 2 superou significativamente o Kit 1. Embora ambos os kits tenham iped uma quantidade semelhante de RNA de controles negativos, o Kit 2 resultou em um rendimento de RNA significativamente maior de amostras positivas. * indica p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 5: Aplicação do método a um modelo mutante. (A)Amostra De confirmação do genótipo de genes de interesse via manchas ocidentais usando um anticorpo personalizado em casa contra o gene da proteína de interesse demonstra gene de interesse-/- (M/M) os machos não produzem a proteína associada. GAPDH mostrado como um controle de carregamento. (B)Saída bioanálise gráfica de entrada pareada e amostras de iped para amostras de tipo selvagem e mutantes. (C) Comparação números de integridade do RNA (RIN) por tipo de amostra e genótipo. (D) Comprimento médio do nucleotídeo das espécies de RNA analisadas pelo bioanalisador por tipo de amostra e genótipo. * indica p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01, N.S. não significativo. N = 4 por genótipo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor. Figura 6: Exemplo de confirmação do motorista cre. Quantificação de um gene traduzido no início do desenvolvimento de células germinativas (Stra8) e dois genes traduzidos no final do desenvolvimento de células germinativas (Tnp1 e Prm1) analisados pelo QRT-PCR do RNA imunoprecipitado de RPL22-HA impulsionado por duas células germinativas diferentes Cres, Stra8-iCre (expressa no início do desenvolvimento de células germinativas) e Hspa2-Cre (expressa mais tarde no desenvolvimento de germes, especificamente após a tradução de Stra88). Aqui, o HA-IP do Stra8 é alcançado com a célula de germes cre driver, mas não com o driver Cre da célula de germes posterior demonstrando especificidade celular da imunoprecipitação. Em contraste, ha-IP de transcrições traduzidas em células germinativas tardias é alcançada tanto por Stra8-iCre quanto Hspa2-Cre. Isso é esperado, pois as células que expressam Stra8-iCre gerarão RPL22 com marca HA durante toda a totalidade de seu desenvolvimento, enquanto aquelas que expressam Hspa2-Cre só o farão durante as partes posteriores de seu desenvolvimento. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Discussion

Entender o traduzo metário de um determinado tipo de célula é inestimável para entender com mais precisão a fisiologia de uma célula no estado normal ou mutante. O benefício especial é visto em sistemas em que a tradução é desacoplado da transcrição, como no tecido neural onde a tradução ocorre muito longe da transcrição, ou em células germinativas onde a transcrição ocorre muito antes da tradução. Em relação a outros métodos de análise traduzome, a maior vantagem do sistema RiboTag vem do uso do sistema Cre recombinase. Isso permite a liberdade de atingir qualquer população celular que tenha um driver Cre relevante. Em segundo lugar, o IP RiboTag descrito aqui é eficaz e muito menos tecnicamente desafiador e demorado do que o perfil polisome ou riboso. Por fim, o IP ribotag pode ser facilmente realizado no banco.

Há uma série de passos críticos neste protocolo. Entre eles, o estabelecimento da linha de camundongos RiboTag e geração de animais experimentais para estudo. Quanto a todos os modelos genéticos, deve-se aplicado um acompanhamento cuidadoso de indivíduos dentro da colônia de camundongos, bem como protocolos de genotipagem cuidadosos. A genotipagem pcr conforme Sanz et al. deve incluir primers visando o site loxP 5′ do exon wildtype 4 para distinguir entre alelos do tipo selvagem (260 bp) e mutante (290 bp)13. Para o caso da análise ribotag em modelos de células germinativas, requisitos de reprodução muito específicos devem ser cumpridos. Primeiro, no caso dos mutantes que resultam em infertilidade, estratégias de reprodução pensativas devem incluir métodos para otimizar o número de descendentes com o genótipo desejado em gerações intermediárias e experimentais. Em segundo lugar, no caso da célula germinal específica cres,deve-se tomar cuidado em relação à zygosidade Credada a sensibilidade das células germinativas à toxicidade Cre. Na célula germinal, altos níveis de proteína Cre podem ter efeitos deletérios22,proibindo o uso de animais Cre/Cre no esquema de reprodução. Por fim, ao usar a célula germinal Cres, é importante isolar a aleela RiboTag do Cre até a geração final, pois a expressão cre na célula germinal de uma geração intermediária resultará em descendentes expressando Rpl22-HA globalmente.

Independentemente do sistema celular, vários controles recomendados são possíveis para verificar a robustez tanto da expressão e especificidade do Cre. A expressão adequada do seu Cre e a esperada excisão do Rpl22-HA podem ser determinadas usando vários métodos. No primeiro, o tecido isolado de animais experimentais pode ser manchado para Ha usando imunohistoquímica ou imunofluorescência15. Este método é ótimo na medida em que não requer um conhecimento priori de mRNAs traduzidos nos tipos de células-alvo. O segundo método, um exemplo do qual é demonstrado na Figura 6,requer algum conhecimento de mensagens traficadas regulamentadas nos tipos de células-alvo. Neste método, o enriquecimento de um mRNA regulamentado traduções conhecido pode ser confirmado a partir do driver Creselecionado usando PCR quantitativo de IPed versus RNA de entrada. Da mesma forma, a expressão robusta Rpl22-HA pode ser confirmada em comparação de amostras Cre+/Rpl22+ (controles positivos) com cre-/Rpl22+ ou Cre+/Rpl22- amostras que atuam como controles negativos eficazes (ver Figura 3). Essas comparações podem ser feitas em RNA totalmente iped ou enriquecimento para um mRNA regulamentado tragicionalmente conhecido avaliado pelo qRT-PCR ou algum outro método quantitativo.

Problemas comuns na execução do protocolo tendem a se tornar evidentes quando o rendimento do RNA é inesperadamente baixo ou alto. A causa mais comum para essas falhas surge da genotipagem incorreta de indivíduos. Recomendamos reter tecido adicional da amostra coletada para confirmar genótipos de todas as amostras no caso de rendimentos inesperados de RNA. Uma vez confirmadas, outras possibilidades devem ser consideradas, incluindo a possibilidade de contaminação do RNase ou degradação amostral. O armazenamento e manuseio e a manutenção cuidadosas de zonas livres de RNase dentro do laboratório podem reduzir ou eliminar muito esses problemas. Embora os problemas de isolamento do RNA sejam outro problema potencial neste protocolo, o uso de kits comerciais reduz muito essa questão, embora o cuidado deva ser tomado para garantir que eles sejam mantidos como livres de RNase e não contenham soluções vencidas. Por fim, como em todos os procedimentos baseados em anticorpos, variações no lote, condições de armazenamento, concentração ou mesmo envio têm o potencial de impactar negativamente a qualidade do anticorpo e o sucesso subsequente do pulldown. Como resultado, após testes cuidadosos e repetidos, escolhemos o anticorpo mais consistente e eficiente disponível.

Este protocolo contém duas grandes modificações em relação a outros protocolos RiboTag publicados que aumentam significativamente a probabilidade de sucesso. Uma delas é a capacidade de usar tecido congelado flash, mitigando assim quaisquer problemas envolvendo variações de lote, técnico ou corrida técnica. Amostras podem ser coletadas e armazenadas permitindo o isolamento de ribossomos HA de todas as amostras ao mesmo tempo, reduzindo o que pode ser grandes fontes de variação. Em segundo lugar, a adição da etapa pré-clara reduz substancialmente o tipo de fundo relatado por outros usuários do sistema RiboTag. Recentemente, um relatório protocolar de Sanz et al. indica a presença de alto nível devido à abundância de transcrições associadas a ribossomos de célulasnão-cre-driven14. Nosso protocolo remedia essa questão, incluindo uma etapa de pré-compensação, eliminando efetivamente a presença de RNA em amostras ip negativas cre.

Como todos os sistemas, as limitações inerentes ao sistema RiboTag devem ser mantidas em mente. Ao utilizar condutores Cre descaracterizados, a análise da expressão deve ser realizada antes da produção experimental da amostra. Do ponto de vista da tradução, várias nuances deste método devem ser notadas. Primeiro, riboTag não permite diferenciação entre mRNAs prontas para traduzir e aqueles traduzindo ativamente. Como tal, os métodos atuais baseados em RiboTag não permitem a quantificação da eficiência de tradução em função de mRNAs individuais. Se a eficiência da tradução for de interesse, ela pode ser medida em uma base específica para celular se o método RiboTag for combinado com outras ferramentas de análise traduzome, como o perfil polisome. Em segundo lugar, é fundamental levar em conta mudanças totais de abundância de RNA decorrentes da variância dependente individual ou genótipo. É por essa razão que o isolamento cuidadoso do RNA de entrada acompanham a imunoprecipitação e amostras derivadas de cada uma permanecem emparelhadas em qualquer análise a jusante. Por fim, e em relação à análise baseada em RiboTag, deve-se lembrar que a associação com um ribossomos não necessariamente prova que a tradução está ocorrendo. Métodos secundários de análise devem ser realizados para confirmar a regulação translacional em metas de interesse.

Este protocolo descreve o isolamento de RNAs associadas ao ribossomo das células germinativas de camundongos machos usando o modelo RiboTag. Não contabilizando a criação de camundongos e coleta de amostras, o protocolo leva dois dias, com três horas do primeiro dia, melhor feito à tarde, uma incubação durante a noite, seguida de cinco horas de trabalho na manhã seguinte. Recomenda-se fortemente que a preparação de soluções de estoque (HB e HSWB), bem como a moagem tecidual sejam feitas com antecedência. O sucesso geral do protocolo depende de genotipagem correta e condições estritamente livres de RNase. A capacidade de examinar o traduzo meto de tipos de células específicas permitirá que estudos futuros entendam melhor a relação entre transcrição, tradução e o proteome em inúmeros tipos de células e antecedentes mutantes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder NICHD R00HD083521 à EMS e apoio interno da Universidade Rutgers à EMS.

Materials

1 mL mechanical pipette Preference of researcher
1,4-Dithio-DL-threitol (8% Alfa Aesar A15797
1.7 mL or 2mL tubes Preference of researcher
10 mL conical tubes Preference of researcher
10 mL serological pippettes Preference of researcher
10 uL mechanical pipette Preference of researcher
20 uL mechanical pipette Preference of researcher
200 uL mechanical pipette Preference of researcher
5 mL serological pipettes Preference of researcher
50 mL conical tubes Preference of researcher
Anti-HA tag antibody Abcam ab18181 Antibody 1
Anti-HA tag antibody Antibodies.com A85278 Antibody 2
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice The Jackson Laboratory 17490 Or mice carrying Cre driver of choice
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice The Jackson Laboratory 11029
Benchtop centrifuge Preference of researcher
C1000 Touch thermal cycler BioRad 184-1100 Or equivalent thermal cycler
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000537 Or equivalent refrigerated centrifuge
Cyclohexamide Sigma Aldrich C7698-1g
Dissection scissors Preference of researcher
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen by ThermoFisher Scientific 10009D
DynaMag-2 Magnet rack Invitrogen by ThermoFisher Scientific 12321D
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 OMEGA 6834-01 Kit 1
Heat block Preference of researcher
Heparin Sigma Aldrich 84020
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272-500g
Microdissection forceps Preference of researcher
Microdissection scissors Preference of researcher
MiRNeasy kit Qiagen 217004 Kit 2
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Or equivalent spectrophotometer
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem Millipore Sigma 492016
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free ThermoFisher Scientific A32965
Potassium (KCl) Sigma Aldrich P3911-2.5kg
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs Inc. M0314
SI vortex-genie 2 Scientific Industries SI-0236 Or equivalent benchtop vortex
Tips for 1 mL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 10 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 20 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 200 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-500
Tube Revolver / Rotator ThermoFisher Scientific 88881001 Or equivalent rotator
VWR Powerpette Plus pipet controller VWR 75856-450 Or equivalent pipette controller
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References

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RiboTagImmunoprecipitationGerm CellsMale MouseRNA ExtractionHomogenization BufferHigh-salt Wash BufferLysis Buffer

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Chukrallah, L. G., Seltzer, K., Snyder, E. M. RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse. J. Vis. Exp. (157), e60927, doi:10.3791/60927 (2020).
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