أخذ العينات وتحليل إشارات رائحة الحيوان
Summary
لقد طورنا منهجية فعالة لأخذ العينات وتحليل إشارات الرائحة من أجل فهم كيفية استخدامها في الاتصالات الحيوانية. على وجه الخصوص ، نستخدم مساحة الرأس الصلبة المرحلة microextraction مقرونة قياس الطيف الكروماتوغرافيا كتلة الغاز لتحليل المكونات المتطايرة من الروائح الحيوانية وعلامات الرائحة.
Abstract
لقد طورنا منهجية فعالة لأخذ العينات وتحليل إشارات الرائحة ، باستخدام مساحة الرأس الصلبة المرحلة microextraction مقرونة قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية الغاز ، لفهم كيفية استخدامها في الاتصالات الحيوانية. تسمح هذه التقنية بإجراء تحليل شبه كمي للمكونات المتطايرة لإفرازات الرائحة من خلال تمكين الفصل وتحديد المكونات في العينة بشكل مؤقت ، يليه تحليل نسب منطقة الذروة للبحث عن الاتجاهات التي يمكن أن تدل على المركبات التي قد تشارك في الإشارات. نقاط القوة الرئيسية لهذا النهج الحالي هي مجموعة أنواع العينات التي يمكن تحليلها؛ عدم الحاجة إلى أي إعداد أو استخراج عينات معقدة؛ القدرة على فصل وتحليل مكونات خليط؛ تحديد المكونات المكتشفة؛ والقدرة على توفير معلومات شبه كمية وربما كمية عن المكونات المكتشفة. ويتعلق القيد الرئيسي للمنهجية بالعينات نفسها. وبما أن المكونات ذات الأهمية المحددة متقلبة، ويمكن أن تضيع بسهولة، أو تتغير تركيزاتها، فمن المهم تخزين العينات ونقلها على النحو المناسب بعد جمعها. وهذا يعني أيضا أن ظروف تخزين العينات ونقلها مكلفة نسبيا. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من العينات (بما في ذلك البول والبراز والشعر وإفرازات رائحة الغدة الرائحة). تتكون هذه الروائح من خليط معقد ، يحدث في مجموعة من المصفوفات ، وبالتالي تتطلب استخدام تقنيات لفصل المكونات الفردية واستخراج المركبات ذات الأهمية البيولوجية.
Introduction
لا يعرف الكثير عن التغيرات الكيميائية التي تقوم عليها الإشارات الشمية فيالحيوانات 1، أيضا بسبب التحديات المنهجية في تسجيل وتحديد ملامح الكيميائية المتطايرة من الروائح2. هناك العديد من المزالق المحتملة عند العمل مع المصفوفات الكيميائية المعقدة للغاية؛ وتشمل هذه عند أخذ العينات وتحليل عينات رائحة3.
في مركز روزاليند فرانكلين للعلوم، جامعة ولفرهامبتون، نقوم بتحليل الروائح وعلامات الرائحة لفهم كيفية استخدامها من قبل الحيوانات. نحن نجمع بين القياس شبه الليمفاوي والبيئة السلوكية والغدد الصماء وعلم الخلايا لتحسين فهمنا للدور الذي تلعبه الإشارات الشمية في الاتصالات الحيوانية.
لقد طورنا منهجية ثم حللنا الروائح والعلامات من مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك العديد من الرئيسيات غير البشرية (أي الليمور المتوج ، الليمور الأحمر ، المكاك الياباني ، الزيتون ، الشمبانزي) والثدييات الأخرى (أي القطط والأبقار). لقد جمعنا وحللنا مجموعة متنوعة من العينات، بما في ذلك البول والبراز والشعر وإفرازات رائحة الغدة الرائحة. هذه الروائح وعلامات الرائحة تتكون من خليط معقد من المركبات، وبالتالي فإن أي منهجية تستخدم لتحليلها تحتاج إلى تضمين شكل من أشكال التقنية الانفصالية. كما هو موضح، فإنها تحدث أيضا في مجموعة من المصفوفات التي تتطلب استخدام تقنيات لاستخراج مكونات الفائدة.
استخدمت الدراسات السابقة التي أجراها Vaglio وآخرون4 ومؤلفون آخرون5 استخراج مساحة الرأس الديناميكية (DHS) مع قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي للغاز (GC-MS) في حين تم استخدام استخراج المذيبات المباشر6 واستخراج المذيبات المعقدة7 أيضا. وعلى وجه الخصوص، ينطوي أخذ عينات مساحة الرأس الديناميكية على تطهير مساحة الرأس بحجم معروف من الغاز الخامل يزيل في نهاية المطاف جميع المركبات المتطايرة باستثناء تلك التي تظهر تقاربا قويا لمصفوفة العينة (على سبيل المثال، المركبات القطبية في عينات مائي).
بالنسبة للمنهجية الحالية ، اعتمدنا تقنية الميكروبسترات المرحلة الصلبة (HS-SPME) إلى جانب GC-MS. على وجه الخصوص، قمنا بتطوير وتعزيز المنهجية المستخدمة بالفعل من قبل Vaglio وآخرون في مختبر GC-MS السابق8و9و10.
تقنيات استخراج المذيبات فعالة جدا لتحليل المركبات الصغيرة، شديدة التقلب (والتي يمكن أن تضيع بسهولة من عينة) لأن هذه الأساليب شل المركبات على مستقرة، ودعم المرحلة الصلبة. يستخدم HS-SPME ألياف مغلفة ببوليمر مرصع لالتقاط المركبات المتطايرة في مساحة الرأس العينة أو لاستخراج المركبات الذائبة عن طريق الغمر في سائل بيولوجي مائي11. طلاء البوليمر لا تربط المركبات بقوة، وبالتالي عن طريق التدفئة في ميناء الحقن من GC أنها يمكن إزالتها. هذه الطريقة هي أكثر قوة من تقنيات استخراج المذيبات وأيضا أكثر فعالية من DHS.
في النهج الحالي يتم احتواء العينات داخل قوارير زجاجية. يتم تسخين هذه القنينات إلى درجة حرارة 40 درجة مئوية لمحاكاة درجة حرارة جسم الحيوان من أجل تعزيز المكونات المتطايرة لعلامة الرائحة لتحتل مساحة رأس القارورة. يتم عرض ألياف SPME ، المغلفة بمواد ماصة 65 ميكرومتر من البوليديمثيلسيل أوكسان / divinylbenzene (PDMS / DVB) ، إلى بيئة مساحة الرأس ويتم امتزاز المكونات المتطايرة من العينة على الألياف. على تسخين الألياف في مدخل منفذ GC-MS، يتم desorbed المكونات المتطايرة من الألياف ومن ثم فصلها من قبل GC. يتم الحصول على أنماط تجزئة طيفية الكتلة لكل مكون باستخدام MS. بالمقارنة مع هذه الأطياف الشاملة ضد قواعد البيانات الطيفية الشاملة، يمكن أن يكون من الممكن تحديد مؤقتا مكونات علامة رائحة. من خلال استخدام العينات التلقائية ، ونحن قادرون على تحليل عينات متعددة على دفعات بطريقة متسقة.
وبالنظر إلى أن كل نوع من ألياف SPME له صلة مختلفة مع المواد الكيميائية القطبية ، وعادة ما يتم اختيار الألياف اعتمادا على القطبية و / أو الوزن الجزيئي للمركبات الكيميائية المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تغيير شروط GC اعتمادا على نوع العمود GC وخصائص المركبات الكيميائية المستهدفة.
وتسمح هذه التقنية بإجراء تحليل شبه كمي للمكونات المتطايرة لعلامات الرائحة من خلال تمكين الفصل وتحديد المكونات في العينة بشكل مؤقت، يليه تحليل نسب منطقة الذروة للبحث عن الاتجاهات التي يمكن أن تدل على مكونات وسم الرائحة التي قد تشارك في الإشارة.
ويتمثل مواطن القوة الرئيسية لهذا النهج الحالي فيما يلي:
- نطاق أنواع العينة التي يمكن تحليلها.
- لا يلزم إعداد عينات معقدة أو استخراجها.
- القدرة على تحليل المكونات المتطايرة.
- القدرة على فصل مكونات الخليط.
- لتكون قادرة على تحديد المكونات المكتشفة.
- القدرة على تقديم معلومات شبه كمية وربما كمية عن المكونات المكتشفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
واستخدام عينات المراقبة، سواء الضوابط البيئية التي أنشئت وقت جمع العينات أو فراغات النظام، أمر حاسم لتفسير عينات علامات الرائحة. وينبغي استبعاد أي قمم تعزى إلى بيئة أخذ العينات أو النظام الآلي من عينات علامات الرائحة بحيث لا يدرج في أي تفسير سوى ذروة الاهتمام. ويمكن لهذه الضوابط أيضا أن ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كيث القابضة لمساعدته في التحليلات الكيميائية في مركز روزاليند فرانكلين للعلوم، ولفرهامبتون، وبن مانتل لإنتاج الفيديو. كما أننا ممتنون للبروفيسور غلوريانو مونيتي والدكتور جوزيبي بيراكسيني وأعضاء مركز قياس الطيف الكتلي في جامعة فلورنسا، فلورنسا، وللبروفيسور لوكا كالاماي والدكتور ماركو ميشيلوزي من مختبر ARCA التابع للمجلس الوطني للمقاومة في فلورنسا، لمساعدتهم في وضع هذه المنهجية. تم دعم المشاريع البحثية التي شملت أساليب أخذ العينات والتحليل الموصوفة في المخطوطة من قبل زمالتين ماري Skłodowska-Curie Intra الأوروبية (معرفات اتفاقية المنح: 327083 ، 703611) ، ومنحة صغيرة (‘الرئيسيات المخصب الحسية‘) من جمعية الرئيسيات في بريطانيا العظمى ، ومنحة بحثية صغيرة (‘هل لدى الصيادين وجامعي الثمار حاسة شم خاصة؟‘) من الأكاديمية البريطانية / صندوق ليفرهولم إلى S.V. كما تلقى العمل المختبري اللازم لإعداد هذه المنهجية تمويلا من مسابقة التمويل السنوية لكلية العلوم والهندسة (ولفرهامبتون) إلى S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
