Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

A clamídia trachomatis é a principal causa de doenças sexualmente transmissíveis bacterianas e representa um fardo significativo para a saúde humana. Mais de 100 milhões de pessoas são infectadas todos os anos com C. trachomatis¹. Aproximadamente 70% das infecções em mulheres são assintomáticas apesar dos efeitos prejudiciais à saúde reprodutiva, como doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e/ou infertilidade. As sequelas da doença estão diretamente relacionadas à imunopatologia iniciada pela infecção por C. trachomatis ². Uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida; portanto, compreender a função de fatores de virulência bacteriana e outros produtos genéticos bacterianos é uma questão de pesquisa importante e urgente.

Como bactérias intracelulares, invasão celular hospedeira, replicação intracelular, liberação de descendência e evasão de respostas imunológicas hospedeiras são processos críticos. C. trachomatis forma uma membrana parasitophorous vinculada ao vacuole, denominada inclusão, para o desenvolvimento intracelular. O estabelecimento da inclusão e muitos outros processos críticos são alcançados por secreção de proteínas effectoras por meio de um sistema de secreção tipo III (T3SS)³. Elucidar as funções desses efetivadores secretos foi limitado por muitos anos devido à intração genética de C. trachomatis. Ao contrário de E. coli,muitas técnicas clássicas de clonagem não são aplicáveis à Clamídia. Algumas grandes limitações envolvem eficiência de transformação, falta de repórteres de contrasseleção, como sacb e manutenção plasmática. Enquanto os plasmídeos E. coli geralmente podem ser mantidos indefinidamente com origem de replicação e pressão seletiva adequada, os plasmídeos C. trachomatis exigem mais oito quadros de leitura abertos (pgp1-8) para manutenção que são encontrados no plasmídeo pL2 nativo dentro do L2 serovar⁴.

Nos últimos anos, foram geradas múltiplas ferramentas genéticas que acomodam a biologia única da Clamídia, mas ainda há limitações^5,6,7. A mutação química pelo tratamento metanosulfona (EMS) pode introduzir mutações missenses, ou (menos frequentemente) pode resultar em transições de nucleotídeos introduzindo um codon parada prematuro para produzir uma mutação sem sentido⁸. A inserção transposon é eficiente para a interrupção genética, mas a tecnologia atual na pesquisa da Clamídia é trabalhosa e^{demorada 9}. Tanto o tratamento ems quanto as técnicas de mutagênese transposon geram mutações aleatórias e exigem métodos rigorosos de triagem para isolar as cepas mutantes. Um método para interromper genes por inserção de intronas do grupo II (por exemplo, TargeTron) permite a mutação gênese dirigida; no entanto, este método é limitado pela eficiência, e o local de inserção nem sempre é devidamente previsto¹⁰.

A mutagênese de troca acetélica relatada pela fluorescência (FRAEM) é uma estratégia usada para exclusão genética direcionada, juntamente com a inserção de um de seleção que proporciona resistência a antibióticos e um repórter de fluorescência¹¹. No entanto, o FRAEM é complicado pelo potencial de efeitos polares induzidos por em genes a jusante, especialmente quando visam genes dentro de operões policistronicos. A troca de acetélica de floxed (FLAEM) é uma nova abordagem genética desenvolvida para aliviar os efeitos polares induzidos por anteriormente observados com o de seleção FRAEM¹². FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção e restaurar a expressão de genes a jusante. O de seleção contendo resistência a antibióticos e proteína fluorescente verde (GFP) é reprojetado com locais de loxP flancos. Esses locais loxP podem se recombinar na presença de Cre recombinase e resultar em excisão do do genoma¹³. Esta estratégia tem sido demonstrada para aliviar os efeitos polares induzidos ao mirar tmeA para exclusão^12,14.

Tanto os métodos FRAEM quanto flaem utilizam o mesmo vetor suicida, pSUmC 4.0, que pode ser mantido condicionalmente através da expressão induutível de pgp6. A expressão do pgp6 já se mostrou necessária para a retenção plasmática e, portanto, é aproveitada para controlar a manutenção plasmática^11,15. Quando C. trachomatis é cultivado na mídia complementada com tetraciclina anidra (aTc) para induzir a expressão pgp6, o vetor é mantido. Na ausência de aTc, o vetor está perdido. A exclusão genética direcionada é alcançada através da troca alelica do gene para a de seleção. As regiões de 3 kb diretamente rio acima e rio abaixo do gene alvo servem como braços de homologia para recombinação. Estes braços são clonados no vetor pSUmC 4.0 flanqueando o de seleção. Eventos bem-sucedidos de transformação e recombinação de C. trachomatis são observados através de relatórios de fluorescência. Expressão de mCherry na espinha dorsal vetorial e gfp dentro do de seleção produz inclusões fluorescentes vermelhas e verdes. Uma vez que o ATc é removido da mídia cultural, as inclusões somente verdes indicam eventos de recombinação bem-sucedidos com a perda do vetor suicida e a integração do de seleção no genoma bacteriano.

FlaEM representa uma extensão do FRAEM através da transformação subsequente de um vetor crerecombinase expresso, pSU-Cre, na recém-criada cepa mutante. A recombinação cre facilita a recombinação entre sites loxP e excisão do de seleção. Eventos de recombinação são indicados através de relatórios de fluorescência. O vetor pSU-Cre codifica mCherry; assim, a transformação bem sucedida é indicada pela adição de fluorescência vermelha ao GFP-expressando inclusões. O cultivo na ausência de pressão seletiva para o resulta em recombinação mediada por Cre nos locais do loxP, e a perda do é indicada por inclusões somente vermelhas. Assim como no pSUmC-4.0, a expressão induutível do pgp6 é usada para manter condicionalmente o pSU-Cre. Uma vez que a seleção de aTc e antibióticos são removidos, o plasmídeo é curado, e a cepa de exclusão sem marcadores resultante é não fluorescente. Este método aborda a questão dos efeitos polares induzidos por.