Масс-спектрометрии-управляемый геном добычи в качестве инструмента для выявления новых природных продуктов

Исследования вторичного метаболизма часто состоят из скрининга сырых экстрактов для конкретных биологических видов деятельности с последующим очищением, идентификацией и характеристикой составляющих, принадлежащих к активным фракциям. Этот процесс оказался эффективным, способствуя изоляции нескольких химических организаций. Тем не менее, в настоящее время это рассматривается как неосуществимый, в основном из-за высоких темпов повторного открытия. Поскольку фармацевтическая промышленность произвела революцию, не зная о роли и функциях специализированных метаболитов, их идентификация проводилась в лабораторных условиях, которые не точно представляли природу^1. Сегодня лучше понять естественные сигнальные влияния, секрецию и наличие большинства целей при неопределимо низких концентрациях. Кроме того, регулирование этого процесса поможет академическому сообществу и фармацевтической промышленности воспользоваться этими знаниями. Это также пойдет на пользу исследованиям, связанным с прямой изоляцией метаболитов, связанных с молчаливыми биосинтетическими генными кластерами (BGCs)².

В этом контексте прогресс в области геномного секвенирования возродил интерес к скринингу метаболитов микроорганизмов. Это связано с тем, что анализ геномной информации нераскрытых биосинтетических кластеров может выявить гены, кодирующих новые соединения, не соблюдаемые и не производимые в лабораторных условиях. Многие микробные проекты всего генома или проекты доступны сегодня, и их число растет с каждым годом, обеспечивая огромные перспективы для раскрытия новых биологически активных молекул через геном добычи^3,4.

Атлас биосинтетических генных кластеров является текущей крупнейшей коллекцией автоматически добытых генных кластеров в качестве компонента интегрированной платформы микробных геномов Объединенного института генома (JGI IMG-ABC)². Совсем недавно, Минимальная информация для биосинтетических генных кластеров (MIBiG) Инициатива по стандартизации способствовала ручной реаннотации BGCs, обеспечивая высоко куратором набор справочных данных⁵. В настоящее время имеется множество инструментов, позволяющих осуществлять вычислительный анализ генетических данных и их связь с известными вторичными метаболитами. Различные стратегии были также разработаны для доступа к новым биологически активным натуральным продуктам (т.е. гетерологическое выражение, удаление целевых генов, восстановление в пробирке, геномная последовательность, изотоп-управляемый скрининг «геномисотемный подход», манипуляции с местными и глобальными регуляторами, добыча на основе сопротивления, культурная независимая добыча полезных ископаемых, и, в последнее время, MS-руководство/код подходы^2,6,9,^{9,9, , 10,11,,12,,13,,14,,15}).

Добыча генома как особая стратегия требует усилий по аннотатам одной или небольшой группы молекул; таким образом, сохраняются пробелы в этом процессе, в которых новые соединения отдают приоритет изоляции и разослать структуру. В принципе, эти подходы нацелены только на один биосинтетический путь в эксперимент, что приводит к медленному показателю открытия. В этом смысле использование Gm наряду с молекулярным подходом сетей представляет собой важный шаг для исследования природного продукта^14,15.

Универсальность, точность и высокая чувствительность жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) делают его хорошим методом для комплексной идентификации. В настоящее время несколько платформ инвестировали алгоритмы и пакеты программного обеспечения для нецелевых метаболомики^{16,,17,,18,,19,,20}. Ядро этих программ включает в себя обнаружение функций (пиковый сбор)²¹ и пиковое выравнивание, что позволяет совпадать с идентичными функциями по пакету образцов и поиску шаблонов. MS шаблон на основе алгоритмов^22,23 сравнить характерные модели фрагментации и матч MS² сходства генерации молекулярных семейств обмена структурными особенностями. Эти функции могут быть выделены и сгруппированы, предоставляя возможность быстро обнаружить известные и неизвестные молекулы из сложного биологического экстракта тандемом MS^2,24,25. Таким образом, тандем MS является универсальным методом получения структурной информации о нескольких хемотипов, содержащихся в большом объеме данных одновременно.

Алгоритм Глобальной естественной молекулярной сети (GNPS)²⁶ использует нормализованную интенсивность ионов фрагментов для построения многомерных векторов, в которых сходства сравниваются с помощью косиновых функций. Взаимосвязь между различными родительскими ионами построена в представлении диаграммы, в котором каждая фрагментация визуализируется как узло (круги), а родственность каждого узла определяется краем (линиями). Глобальная визуализация молекул из одного источника определяется как молекулярная сеть. Структурно расходящиеся молекулы, которые фрагментируют однозначно, образуют свое собственное конкретное скопление или созвездие, в то время как связанные молекулы сгруппируются вместе. Кластеризация хемотипов позволяет гипотетическое соединение аналогичных структурных особенностей с их биосинтетическим происхождением.

Сочетание как хемотипа к генотипу, так и подходов к генотипу к хемотипу является мощным при создании биоинформатичных связей между BGCs и их небольшими молекулярными продуктами^27. Таким образом, добыча генома с MS-наведением является быстрым методом и низкой потребляющей материал стратегией, и она помогает преодолеть родительские ионы и биосинтетические пути, выявленные WGS одного или нескольких штаммов в различных метаболических и экологических условиях.

Рабочий процесс этого протокола(рисунок 1) состоит из подачи данных WGS в биосинтетическую платформу аннотации генного кластера, такую как antiSMASH^28,,29,30. Это помогает оценить разнообразие соединений и класс соединений, кодируется геномом. Стратегия для целевой биосинтетического генного кластера кодирования химической сущности, представляющие интерес, должны быть приняты, и культура экстракты из штамма дикого типа и / или гетерологовой штамм, содержащий BGC могут быть проанализированы для создания кластерных ионов на основе сходства с помощью GNPS^26,31. Следовательно, можно определить новые молекулы, которые ассоциируются с целевым BGC и недоступны в базе данных (в основном неизвестные аналоги, иногда производимые в низких титрах). Уместно учитывать, что пользователи могут вносить свой вклад в эти платформы и что доступность биоинформатики и данных MS/MS быстро растет, что ведет к постоянному развитию и модернизации эффективных вычислительных инструментов и алгоритмов для руководства эффективными соединениями сложных экстрактов с молекулами.

Рисунок 1: Обзор всего рабочего процесса. Показано иллюстрация биоинформатических, клонирующих и молекулярных сетей, участвующих в описанном подходе к добыче генома с гидом MS для выявления новых метаболитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Этот протокол описывает быстрый и эффективный рабочий процесс для объединения добычи генома и молекулярных сетей в качестве отправной точки для конвейера по открытию природных продуктов. Хотя многие приложения способны визуализировать состав и родственность MS-обнаруживаемых молекул в одной сети, некоторые из них приняты здесь, чтобы визуализировать структурно похожие кластерные молекулы. Используя эту стратегию, успешно идентифицируются новые циклодепсипептидные продукты, наблюдаемые в метаболических экстрактах streptomyces sp. CBMAI 2042. Руководствуясь добычей генома, весь биосинтетический ген кластер, кодируя для валиномицинов, распознается и клонируется в штамм производителя Streptomyces coelicolor M1146. Наконец, после MS шаблон на основе молекулярной сети, молекулы, обнаруженные MS коррелируют с BGCs ответственность за их биогенеза³².