Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung¹ und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da Informationen zur Gewebearchitektur, zur räumlichen Verteilung von Zellen und zur Antigen-Co-Expression alle in einer einzigen Gewebeprobe erfasst werden². Der Einsatz multispektraler Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie hat den Nachweis mehrerer biologischer Marker ermöglicht. In dieser Technologie können die Fluoreszenzspektren jedes einzelnen Fluorophors durch spezifische Optik getrennt oder “ungemischt” werden, was die Detektion mehrerer Marker ohne Spektralüberlauf^{ermöglicht 3}. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wird zu einem kritischen Ansatz in der Zellbiologie, präklinischen Arzneimittelentwicklung, klinischen Pathologie und Tumorimmunprofilierung^4,5,6. Wichtig ist, dass die räumliche Verteilung von Immunzellen (speziell CD8-T-Zellen) als prognostischer Faktor für Patienten mit bestehenden Tumoren dienen kann⁷.

Verschiedene Ansätze zur Multiplexfluoreszenzfärbung wurden entwickelt und können entweder gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Bei der gleichzeitigen Färbemethode werden alle Antikörper als Cocktail in einem einzigen Schritt zusammengefügte, um das Gewebe zu kennzeichnen. Die UltraPlex-Technologie verwendet einen Cocktail von haptenkonjugierten Primärantikörpern, gefolgt von einem Cocktail fluorophor-konjugierter antihapten sekundärer Antikörper. Die InSituPlex-Technologie⁸ verwendet einen Cocktail aus einzigartigen DNA-konjugierten Primärantikörpern, die dem Gewebe gleichzeitig zugesetzt werden, gefolgt von einem Amplifikationsschritt und schließlich fluorophorkonjugierten Sonden, die jede einzigartige DNA-Sequenz am primären Antikörper ergänzen. Beide Technologien ermöglichen den Nachweis von vier Markern plus 4′,6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) für die kerntechnische Färbung. Zwei weitere Ansätze zur simultanen Multiplexfärbung basieren auf der sekundären Ionenmassenspektrometrie⁹. Das Hyperion Imaging System verwendet bildgebende Massenzytometrie^10, um bis zu 37 Marker zu erkennen. Diese Technologie verwendet einen Cocktail aus metallkonjugierten Antikörpern, um das Gewebe zu färben, und bestimmte Bereiche des Gewebes werden durch einen Laser ablated und auf ein Massenzytometer übertragen, wo die Metallionen nachgewiesen werden. Eine weitere ähnliche Technologie ist der IONPath, der Multiplex-Ionen-Strahl-Bildgebungstechnologie¹¹verwendet. Diese Technologie verwendet ein modifiziertes Massenspektrometrieinstrument und eine Sauerstoffionenquelle anstelle von Laser, um die metallkonjugierten Antikörper abzuschleifen. Während all diese simultanen Multiplex-Färbeansätze den Nachweis mehrerer Marker ermöglichen, sind die Kosten für die Konjugation von DNA, Hapten oder Metallen zu Antikörpern, der Gewebeverlust durch Ablation und die umfangreiche Bildverarbeitung zum Entmischen nicht zu unterschätzen. Darüber hinaus sind Kits und Färbeprotokolle derzeit nur für FFPE-Gewebe verfügbar, und die Entwicklung von kundenspezifischen Panels erfordert zusätzlichen Zeit- und Aufwand.

Die sequenzielle Multiplex-Färbungsmethode hingegen umfasst die Kennzeichnung des Gewebes mit einem Antikörper auf einen Marker,, um den Antikörper zu entfernen, gefolgt von sequenziellen Wiederholungen dieses Prozesses, um mehrere Marker¹²zu beschriften. Die Tyramidsignalverstärkung (TSA) ist die am häufigsten verwendete sequenzielle Multiplexing-Methode. Zwei weitere Multiplexing-Technologien verwenden eine Kombination aus simultanen und sequentiellen Färbemethoden. Die CODEX-Plattform¹³ verwendet einen Cocktail von Antikörpern, die zu einzigartigen DNA-Oligonukleotidsequenzen konjugiert sind, die schließlich mit einem Fluorophor mit einem indizierten Polymerisationsschritt gekennzeichnet werden, gefolgt von Bildgebung, Abisolieren und Wiederholen des Prozesses, um bis zu 50 Marker zu erkennen. Der MultiOmyx Multiplex-Färbungsansatz¹⁴ ist eine Iteration der Färbung mit einem Cocktail von drei bis vier fluorophorkonjugierten Antikörpern, bildgebend, das Abschrecken der Fluorophore und die Wiederholung dieses Zyklus, um bis zu 60 Marker auf einem einzigen Abschnitt zu erkennen. Ähnlich wie bei der gleichzeitigen Multiplex-Färbungsmethode, während eine breite Palette von Markern erkannt werden kann, ist die Zeit, die mit Färbung, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse verbunden ist, umfangreich. Der Stripping/Quenching-Schritt beinhaltet das Erhitzen und/oder Bleichen der Gewebeprobe und somit wird der sequenzielle Multiplex-Färbungsansatz häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die die Gewebeintegrität beim Erhitzen oder Bleichen erhalten.

Formalin Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung wird leicht in einer klinischen Umgebung durchgeführt, Gewebeblöcke sind einfach zu lagern, und mehrere Multiplex-Färbung Protokolle sind verfügbar. Die Verarbeitung, Einbettung und Deparaffinisierung von FFPE-Geweben sowie Antigenabruf¹⁵, ein Prozess, bei dem Antikörper besser auf Epitope zugreifen können, ist jedoch zeitaufwändig. Darüber hinaus trägt die Verarbeitung in FFPE-Geweben zur Autofluoreszenz¹⁶ bei und maskiert Zielepitope, was zu der Variabilität und dem Mangel an Antikörperklon führt, die zum Nachweis von Antigenen in FFPE-Geweben^17,18,19zur Verfügung stehen. Ein Beispiel ist die menschliche Leukozytenantigen (HLA) Klasse I Allele²⁰. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Einfrieren von Geweben keine umfangreichen Verarbeitungsschritte vor oder nach der Fixierung, wodurch die Notwendigkeit eines Antigenabrufs^21,22umgangen wird und es für die Erkennung einer breiteren Palette von Zielen von Vorteil ist. Daher kann die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wertvoll sein, um Ziele für präklinische und klinische Studien zu detektieren.

Angesichts der oben genannten Einschränkungen bei der Verwendung von FFPE-Geweben haben wir gefragt, ob multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben durchgeführt werden kann. Um diese Frage zu beantworten, testeten wir eine simultane Multiplex-Färbungsmethode mit einem Panel von fluorophorkonjugierten Antikörpern, um mehrere Antigene zu erkennen, und analysierten die Färbung mit einem semiautomatisierten multispektralen Bildgebungssystem. Wir konnten innerhalb von 90 min bis zu sechs Marker in einem einzigen Gewebeabschnitt färben.