冷冻组织部分多光谱荧光成像的快速方法

最近显微成像技术的进步大大增进了我们对生物过程和疾病状态的了解和理解。通过致色免疫组织化学（IHC）对组织中的蛋白质进行原位检测，在病理学中进行。然而，使用色谱IHC染色检测多个标记是具有挑战性的^1，使用多路免疫荧光（mIF）染色方法的较新的方法，其中多个生物标记标记在单个组织样本上，正在开发中。多个生物标记的检测是有用的，因为有关组织结构、细胞空间分布和抗原共表达的信息都捕获在单个组织样本²中。多光谱荧光成像技术的使用使得检测多种生物标记成为可能。在这项技术中，使用特定的光学元件可以分离或”不混合”每个荧光波的荧光光谱，从而在没有任何光谱串扰³的情况下检测多个标记。多光谱荧光成像正在成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫功能^{44、5、65,6}的关键方法。重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的分量可以作为现有肿瘤患者的预后因子^7。

已经开发了多种荧光染色的各种方法，可以同时或按顺序执行。在同时染色的方法中，所有抗体在一个步骤中作为鸡尾酒一起加入，以标记组织。UltraPlex 技术使用触觉结合的初级抗体的鸡尾酒，然后采用氟磷结合抗触觉二次抗体的鸡尾酒。InSituPlex 技术⁸使用独特的 DNA 结合原抗体的混合物，这些抗体同时添加到组织中，然后进行放大步骤，最后是荧光结合探，这些探针与原抗体上每个独特的 DNA 序列相辅相成。这两种技术都能够检测四个标记和4’，6-2-苯胺烯酰胺（DAPI）的核染色。同时进行多路复用染色的另外两种方法是基于二次肌体质谱^9。Hyperion 成像系统使用成像质量细胞学¹⁰来检测多达 37 个标记。该技术使用金属结合抗体的混合物来染色组织，组织的特定区域被激光清除，并转移到检测到金属离子的量量细胞计中。另一个类似的技术是IONPath，它使用多路复用的ion光束成像技术^11。该技术使用经过改进的质谱仪和氧心源代替激光来清除金属偶联抗体。虽然所有这些同时多重染色方法能够检测多个标记，但无法低估将DNA、触觉或金属结合到抗体中所涉及的成本、消融造成的组织损失以及大量用于解混合的图像处理。此外，套件和染色协议目前仅适用于 FFPE 组织，开发定制面板需要额外的时间和支出。

相反，顺序多路复用染色方法包括将带有抗体的组织标记到一个标记，剥离以去除抗体，然后连续重复此过程以标记多个标记¹²。酪氨酸信号放大 （TSA） 是最常用的顺序多路复用方法。另外两种复用技术采用同时和顺序染色方法的组合。CODEX 平台¹³采用与独特的 DNA 寡核苷酸序列结合的抗体鸡尾酒，最终使用指数聚合步骤标记荧光磷，然后成像、剥离和重复这一过程，以检测多达 50 个标记。MultiOmyx 多路复用染色方法¹⁴是染色的迭代，其混合物由 3 到 4 个荧光素偶联抗体、成像、淬火荧光波和重复此循环来检测单个部分多达 60 个标记。与同时多重染色方法类似，虽然可以检测出广泛的标记，但染色、图像采集、处理和分析的时间也很大。剥离/淬火步骤涉及加热和/或漂白组织样本，因此，顺序多路复用染色方法通常对 FFPE 组织执行，在加热或漂白时保持组织完整性。

正式固定和随后的石蜡嵌入很容易在临床环境中进行，组织块易于存储，并提供多种多路染色方案。然而，FFPE组织的处理、嵌入和去压化，以及抗原检索^15，抗体可以更好地获得表皮的过程，是费时的。此外，FFPE组织中的处理有助于自荧光¹⁶和口罩目标表皮，导致变异和缺乏抗体克隆可用于检测FFPE组织17，18，19的抗原。^17,18,19一个例子是人类白细胞抗原（HLA）类I等位基因^20。相反，组织的快速冻结不涉及修复前后的广泛处理步骤，无需对抗原检索^21、22,22进行检测，有利于检测更广泛的靶点。因此，使用冷冻组织进行多光谱荧光成像对于检测临床前和临床研究的目标很有价值。

鉴于上述使用FFPE组织的限制，我们询问是否可以对冷冻组织进行多光谱荧光成像。为了解决这个问题，我们测试了一种同时使用荧光素结合抗体面板的多路复用染色方法，以检测多种抗原，并使用半自动多光谱成像系统对染色进行了分析。我们能够在90分钟内同时在单个组织部分中染色多达六个标记。