Visualizzazione e analisi delle arterie dell'arco faringo utilizzando immunohistochimica a monte intero e ricostruzione 3D
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare e analizzare le arterie dell’arco faringeo 3, 4 e 6 degli embrioni di topo usando immunofluorescenza a montaggio intero, radura dei tessuti, microscopia confocale e ricostruzione 3D.
Abstract
La formazione o il rimodellamento improprio delle arterie dell’arco faringeo (PAA) 3, 4 e 6 contribuiscono ad alcune delle forme più gravi di malattia cardiaca congenita. Per studiare la formazione di PAA, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza immunofluorescenza a montaggio intero accoppiato con la radura del tessuto alcool/benzyl benzoate (BABB) e la microscopia confocale. Ciò consente la visualizzazione dell’endotelio dell’arco faringeo ad una risoluzione cellulare fine e la connettività 3D della vascolatura. Utilizzando il software, abbiamo stabilito un protocollo per quantificare il numero di cellule endoteliali (EC) nelle PAA, così come il numero di EC all’interno del plesso vascolare che circonda i PAA all’interno degli archi pharyngeal 3, 4 e 6. Se applicata all’intero embrione, questa metodologia fornisce una visualizzazione completa e un’analisi quantitativa della vascolatura embrionale.
Introduction
Durante l’embriogenesi del topo, le arterie dell’arco fantasma (PAA) sorgono come coppie simmetriche e bilaterali di arterie che collegano il cuore con le aortae dorsali1. Man mano che l’embrione si sviluppa, la prima e la seconda coppia di PAA regrediscono, mentre le 3rd,4the 6PAA subiscono una serie di eventi di rimodellamento asimmetrici per formare le arterie dell’arco aortico2.
I PAA 3, 4 e 6 si sviluppano attraverso la vasculogenesi, che è la formazione de novo dei vasi sanguigni3. I difetti nella formazione o nel rimodellamento di queste arterie ad arco danno origine a vari difetti cardiaci congeniti, come quelli osservati nei pazienti con sindrome di DiGeorge4,5. Pertanto, comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo dei PAA può portare a una migliore comprensione dell’eziologia delle malattie cardiache congenite (CHD).
Gli attuali approcci per la visualizzazione e l’analisi dello sviluppo PAA includono l’immunofluorescenza delle sezioni tissutali, i calchi vascolare, l’iniezione di inchiostro dell’India, la microscopia episcopica ad alta risoluzione e/o l’immunohistochimica a monte intero1,4,5,6,7. Qui, descriviamo un protocollo che combina l’immunofluorescenza a montaggio intero, la microscopia confocale e il rendering delle immagini 3D al fine di raccogliere, analizzare e quantificare i dati volumetrici, la connettività vascolare e l’identità cellulare. Inoltre, dettagliamo un metodo per compartimentare e quantificare il numero di EC in ogni arco faringeo come mezzo per studiare la formazione del plesso vascolare dell’arco faringeo e il suo rimodellamento nei PAA. Mentre questo protocollo è progettato per l’analisi dello sviluppo PAA, può essere utilizzato per analizzare altre reti vascolari in via di sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di visualizzare l’endotelio negli embrioni di topo in 3D ha fornito nuove intuizioni sul loro sviluppo3. Qui presentiamo un protocollo che consente l’imaging 3D ad alta risoluzione degli embrioni, la visualizzazione della connettività vascolare e analisi quantitative della formazione di PAA. Questo protocollo può essere impiegato per vedere come le alterazioni genetiche o gli insulti ambientali influiscono sullo sviluppo PAA. La procedura qui riportata utilizza anticorpi contro VEGF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Brianna Alexander, Caolan O’Donnell e Michael Warkala per un’attenta lettura e modifica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti del National Heart, Lung and Blood Institute del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR è supportato da NHLBI HL103920-08S1 e dall’Istituto Nazionale di Artrite e Musculoscheletrie e Malattie della Pelle Sovvenzionia T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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