Этот рабочий процесс описывает производительность времени и экономически эффективного обогащения нескольких белковых посттрансляционных модификаций (ПТМ) одновременно для количественного глобального протеомического анализа. Протокол использует пептидного уровня PTM обогащения с несколькими конъюгированными антителами, а затем данные-независимых приобретения масс-спектрометрии анализа для получения биологической информации в PTM перекрестный разговор.
Изучение нескольких посттрансляционных модификаций (ПТМ) белков является важным шагом для понимания перекрестного разговора PTM и получения более целостного понимания функции белка. Несмотря на важность многофункциональных исследований по обогащению ПТМ, несколько исследований исследуют более одного ПТМ за один раз, частично из-за расходов, времени и больших количеств белка, необходимых для выполнения нескольких глобальных протеомных анализПТ. Обогащение сродства “одного горшка”, подробно описанное в этом протоколе, преодолевает эти барьеры, позволяя одновременное выявление и количественную оценку пептидов с остатками лизина, содержащими ацетилирование и succinylation PTMs с низким количеством выборки Вход. Протокол включает в себя подготовку белкового лизата из мышечной печени мышей-нокаутов SIRT5, производительность пищеварения трипсина, обогащение ПТМ и производительность масс-спектрометрического анализа с использованием рабочего процесса по сбору данных (DIA). Поскольку этот рабочий процесс позволяет обогащать два ПТМ из одного и того же образца одновременно, он предоставляет практический инструмент для изучения перекрестного разговора PTM, не требуя больших количеств образцов, и это значительно сокращает время, необходимое для подготовки образца, данные приобретение и анализ. Компонент DIA рабочего процесса предоставляет всеобъемлющую информацию о PTM-специфических данных. Это особенно важно при изучении локализации участка PTM, так как DIA предоставляет полные наборы фрагментов ионов, которые могут быть расшифрованы с точки зрения вычислений, чтобы различать различные изоформы локализации ПТМ.
Множество посттрансляционных модификаций динамически регулируют белки и пути через воздействие на активность1, сигнализацию2,и оборот3,4. Например, белковые киназы активируются или деактивируются при добавлении фосфатных групп5,а ацетилирование гистона и другие модификации обеспечивают механизм изменения структуры хроматина и служат транскрипционными регулятивными механизмами6,7. В последние годы, доказательства установлены, что несколько PTMs работать в согласии или конкурировать для регулирования функции белка или деятельности8,9,10,11. Таким образом, понимание перекрестного разговора PTM является нарождающейся потребностью в исследованиях PTM. Однако большинство доступных протеомических рабочих процессов для выявления и количественной оценки сайтов PTM сосредоточены на отдельных модификациях, а не на взаимосмежаже, в ходе чем несколько модификаций. Описанный рабочий процесс коррелирует с конкретными белковыми модификациями «горячих точек» и остатками лизина, которые модифицируются несколькими различными ПТМ.
Существует растущая потребность в научном сообществе для осуществимых методов для изучения нескольких ПТМ одновременно12. Большинство методов для глобальной идентификации и количественной оценки сайтов нескольких типов ПТМ являются сложными из-за высоких затрат и количества тканей требуется12,13. Мало того, что многократные эксперименты по обогащению PTM отнимают много времени с точки зрения подготовки образцов, сбора данных и анализа данных, но эти исследования обычно требуют больших и часто непомерно высокой степени белка11. Описано здесь протокол для одновременного обогащения и анализа нескольких ПТМ, который также рассматривает некоторые из этих барьеров и позволяет крупномасштабных PTM профилирования и оценки перекрестного разговора между различными PTMs14. Этот рабочий процесс в один горшок излагает практический способ для биомедицинских исследователей глобально профиль нескольких PTMs, определить совместно модифицированные пептиды, и изучение PTM перекрестный стебель в эффективный и экономически эффективный способ14,15.
Здесь этот метод демонстрируется путем изучения митохондриального белка ацилации, которая была впервые изучена более 50 лет назад16. Он специально концентрируется на ацетилирование лизина17 и succinylation18, в том числе совместное возникновение этих изменений на белки и даже совместной модификации на уровне пептида. Так как исследование использует sirtuin 5 (SIRT5) нокаут мыши модели, он был выбран, чтобы сосредоточиться на обогащении ацетилации и succinylation сайтов. Это решение было принято потому, что succinylation сайты являются целями SIRT5 desuccinylase и, таким образом, как ожидается, показать значительное upregulation в KO мышей, что делает их наиболее актуальными PTMs в этом случае. Оба ПТМ биологически актуальны, как недавно обобщены Carrico et al.19. В целом, ацетилирование показывает важное влияние на экспрессию генов и обмен веществ, и succinylation было сообщено, чтобы регулировать метаболизм сердца и функции20.
Описанный протокол может быть выполнен с низким количеством материала для ввода белка (например, 1 мг белка лизата) и уменьшает общую продолжительность эксперимента за счет сокращения времени, затрачиваемого на обработку образцов, приобретение MS и анализ данных. Схема рабочего процесса приведена на рисунке 1. Мы также использовали еще меньшее количество исходного материала (до 100 мкг белка лизата, масштабирование вниз количество шариков, используемых соответственно), что, как и ожидалось, снижает общую урожайность выявленных ацилатированных пептидов; однако, он по-прежнему обеспечивает весьма ценные результаты и количественные ацитилированные пептиды.
В то время как так называемые сверху вниз или среднего вниз рабочие процессы, как правило, не используют протеолитические подходы к пищеварению (и, таким образом, поддерживать связь нескольких ПТМ в пределах одного белка), этот протокол фокусируется на пептид основе сродства обогащения подход, чтобы получить дополнительную глубину и чувствительность для идентификации И количественной оценки PTM (Рисунок 1). Кроме того, этот пептид-ориентированный рабочий процесс использует современные методы масс-спектрометрии, в том числе 1) комбинацию взаимозависимости данных (DDA) для создания спектральных библиотек и 2) независях от данных приобретения (DIA) для точной количественной оценки PTM в процессе, свободном от меток.
Рабочие процессы DIA преодолевают стохастичность выборки типичных схем сканирования ДДА, всесторонняя фрагментация всех пептидных сигналов в пределах выборки м/з диапазона21. Эта функция также чрезвычайно полезна с точки зрения локализации участка, потому что легче получить информацию о том, какие конкретные ионы фрагментов модифицируются в пептид. Кроме того, рабочие процессы DIA позволяют идентифицировать и количественно определить незначительные изоформы ПТМ-пептида с идентичными ионами прекурсоров. Методы ДИА могут также определить конкретную локализацию участка ПТМ в пептиде на основе конкретных соответствующих ионов фрагментов, которые всесторонне измеряются в любое время. Тем не менее, подходы DDA часто используют функции “динамического исключения”, которые исключают несколько выборок MS/MS для одного иона предшественника, тем самым не хватает незначительных изоформ PTM.
Описанная здесь стратегия одновременного обогащения идеально подходит для исследований, которые выиграют от глобального профилирования и количественной оценки нескольких ПТМ, изучения перекрестного разговора PTM и понимания динамических взаимодействий посттрансляционных модификаций. Идентификация нескольких обогащенных ПТМ в одном комбинированном рабочем процессе была описана: глобальным, последовательным или параллельным обогащением ПТМ, содержащим протеолитические пептиды, или же путем анализа нетронутых белков. В прямом сравнении с серийным обогащением ацетилирования и succinylation, эффективность методологии одного горшка была установлена как очень похожая14. Эти альтернативные протоколы требуют значительного количества исходного материала и времени и могут быть непомерно дорогими. В отличие от этого, протокол с одним горшком предоставляет недорогой и эффективный метод обогащения более чем одного PTM с последующим анализом и идентификацией.
Мышь ткани печени получены из SIRT5 нокаут мышей и используются здесь в качестве исходного материала. Этот протокол также может быть выполнен для лисатов белка из различных тканей или экспериментов клеточной культуры. Этот протокол может быть применен к белкам lysates, полученных из тканей или клеточной культуры гранул.
Этот протокол описывает новый метод для одновременного многократного обогащения PTM, чтобы более эффективно понять перекрестный разговор PTM. Альтернативные методы достижения этой цели, как правило, непомерно отнимают много времени и дорого, и они требуют большого количества белка, чтобы быть успешным11,13. Этот протокол представляет собой многофункциональный рабочий процесс по обогащению ПТМ, который включает в себя инкубацию в антителах- конъюгированных бусин сразу для двух ПТМ для повышения общей эффективности эксперимента. Этот метод также включает в себя использование DDA для генерации спектральной библиотеки и DIA MS приобретений для обнаружения и количественной оценки пептидов настоящее время с уменьшенным помехи от фрагментов ионов22,23. Программные программы, такие как движки поиска баз данных MS, используются для анализа и количественной оценки данных, полученных в результате приобретений DDA, в то время как количественное программное обеспечение ProteomicsSoftware 24 и специфическое программное обеспечение для количественного анализа DIA25 необходимы для интерпретации сложных спектров, производимых приобретениями DIA.
В этом протоколе есть несколько важных шагов, которым следует внимательно следовать. Поскольку основной целью протокола является обогащение для нескольких ПТМ одновременно, шаг по обогащению антител-сродства (раздел 2) имеет решающее значение для успеха эксперимента. При выполнении стихов на бисере необходимо обеспечить, чтобы ни один из бисера не аспирированы случайно. Обеспечение концентрации мочевины была разбавлена до 1 М до пищеварения с трипсина (шаг 1.8) также необходимо. Хотя 8 M мочевины требуется ранее в протоколе для растворимости белка, концентрации мочевины выше 1 М будет препятствовать ферментативной активности трипсина. Кроме того, важно последовательно проверять рН образца на протяжении всего протокола. Это особенно важно до пищеварения. Если рН образца и раствор трипсина не нейтрализуются надлежащим образом до инкубации, это может привести к неэффективному пищеварению, в результате чего многие участки расщепления могут быть пропущены, что приведет к меньшему количеству пептидных идентификаций.
Несколько изменений в протоколе могут быть полезны при подготовке образцов. Для белка лисат закуплено от 1 мг исходного материала, четверть бусин антител, предусмотренных в каждой трубке сканирования PTM может быть использован в качестве экономически эффективной альтернативы. Большее количество исходного материала может быть использовано для улучшения результатов, до тех пор, как количество антител бисера используются пропорционально. Еще одна модификация, которая может повысить рабочий процесс, чтобы переварить образцы с другой протеазой в дополнение к трипсин. Эта модификация приведет к большей изменчивости пептидов расщепляется, обеспечивая более широкий охват остатков белка. Хотя это и не обязательно, рекомендуется, чтобы трипсин быть одним из ферментов, используемых для анализа PTM из-за его высокой специфичности расщепления26.
Ограничение этого протокола заключается в том, что изучаемые ПТМ должны иметь аналогичные химии для того, чтобы обогащаться одновременно14. Процедуры для различных антител-конъюгированных шариков должны быть аналогичными, используя аналогичные растворители и решения, в том числе аналогичные условия elution, и предпочтительно от того же поставщика. По этой причине, метод, изложенный здесь последовательно использует ацетилирование и succinylation в качестве примера, оба из которых используют антитела конъюгированные бусы (Cell Signaling Technology, Inc). Хотя теоретически этот метод может применяться к любому числу ПТМ, потребуются дополнительные исследования для оценки точного ограничения протокола в этом отношении. Кроме того, поскольку это метод обогащения на основе антител, метод может обеспечить только относительную количественную оценку участков ПТМ.
По сравнению с существующими методами обогащения мультиПТМ этот рабочий процесс является более осуществимой и экономически эффективной альтернативой. В ходе этого эксперимента было отмечено, что эффективность этого метода очень хорошо сопоставляется с альтернативными методами, такими как индивидуальное или серийное обогащение. На рисунке 2B показано, что среднее резюме для модифицированных пептидных пиковых зон было фактически уменьшено в методе одного горшка по сравнению с одно-PTM обогащения и серийных PTM обогащения13. Мы также проанализировали экспериментальные результаты оценки количественных показаний на уровне сайта для ацетилирования или сучинки. Кроме того, анализ корреляции Спирмана(рисунок 2C,D) показал, что обогащение PTM-одного горшка выполнено аналогично рабочим процессам по обогащению одного PTM. Это также относится к корреляциям пептид- и фрагментов. Одно и то же наблюдение проводилось для всех трех корреляций при сравнении одного горшка с серийным обогащением PTM.
Этот протокол позволяет исследователям сделать увлекательное биологическое понимание перекрестного разговора PTM быстрым и экономически эффективным образом. Компонент DIA рабочего процесса позволяет исследователям понять больше о PTMs, так как он предоставляет информацию о локализации сайта и преодолевает такие проблемы, как низкая заполняемость места PTMs. Ионы прекурсоров, как правило, исключаются с DDA, что особенно важно при изучении PTMs, так как заполняемость сайта часто низка до такой степени, что эти пептиды не выбираются для MS/MS, но все еще содержат важную информацию. Последующие эксперименты могут быть проведены для оценки верхнего предела, сколько ПТМ могут быть обогащены одновременно с помощью этого метода. Будущее улучшение этого рабочего процесса может включать в себя разработку более продвинутых программных платформ для дальнейшей автоматизации анализа локализации сайта и заполняемости сайта PTM.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем поддержку со стороны NIH общий инструментальный грант для системы TripleTOF в Институте Бака (1S10 OD016281). Эта работа была также поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI108255 до B.S.) и Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек (R24 DK085610 Эрику Вердину; R01 DK090242 Эрику Гетцману). X.X. была поддержана грантом от Национальных институтов здравоохранения (NIH грант T32GM8806, Джудит Кампизи и Лиза Эллерби), Н.Б. была поддержана постдокторской стипендией от Фонда Гленн для медицинских исследований.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |