이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.
단백질의 여러 번역 후 수정 (PTM)을 공부하는 것은 PTM 누화를 이해하고 단백질 기능에 대한 보다 전체적인 통찰력을 얻는 중요한 단계입니다. 다중 PTM 농축 연구의 중요성에도 불구하고, PTM의 여러 글로벌 단백질 분석을 수행하는 데 필요한 비용, 시간 및 대량 단백질 수량으로 인해 한 번에 하나 이상의 PTM을 조사하는 연구는 거의 없습니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 “원 포트” 선호도 농축은 적은 양의 시료를 함유하는 리신 잔류물을 함유하는 펩티드의 동시 식별 및 정량화를 허용함으로써 이러한 장벽을 극복합니다. 입력. 이 프로토콜은 SIRT5 녹아웃 마우스의 마우스 간에서 단백질 용해물 의 준비, 트립신 소화의 성능, PTM에 대한 농축, 데이터 독립적 인 수집 (DIA) 워크플로우를 사용하여 질량 분광 분석의 성능을 포함한다. 이 워크플로우를 통해 동일한 샘플에서 두 개의 PTM을 동시에 보강할 수 있으므로 많은 양의 샘플없이 PTM 누화를 연구할 수 있는 실용적인 도구를 제공하며 샘플 준비, 데이터 처리에 필요한 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 인수 및 분석. 워크플로의 DIA 구성 요소는 포괄적인 PTM 관련 정보를 제공합니다. DIA는 서로 다른 PTM 지역화 이소폼을 구별하기 위해 계산적으로 해독할 수 있는 포괄적인 조각 이온 세트를 제공하기 때문에 PTM 사이트 지역화를 연구할 때 특히 중요합니다.
번역 후 변형의 무수한 동적으로 활성에 대한 효과를 통해 단백질과 경로를 조절1,신호2,회전율3,4. 예를 들어, 단백질 키나아제는 인산염기5의첨가에 의해 활성화 또는 비활성화되고, 히스톤 아세틸화 및 기타 변형은 염색질 구조를 변화시키고 전사 조절메커니즘으로작용하는 메커니즘을 제공한다6,7. 최근 몇 년 동안, 증거는 여러 PTM이 콘서트에서 작동하거나 단백질 기능 또는활성을조절하기 위해 경쟁8,9,10,11탑재하고있다. 따라서 PTM 크로스토크를 이해하는 것은 PTM 연구에서 새로운 필요성입니다. 그러나 PTM 사이트를 식별하고 정량화하는 대부분의 proteomic 워크플로는 여러 수정의 상호 작용이 아니라 단일 수정에 중점을 둡니다. 기재된 워크플로우는 다중 상이한 PTM에 의해 수정되는 특정 단백질 변형 “핫스팟” 및 라이신 잔류물의 상관관계를 나타냅니다.
여러 PTM을 동시에 연구하는 실행 가능한 방법에 대한 과학계의 필요성이 증가하고있습니다 12. 전 세계적으로 PTM의 여러 유형의 사이트를 식별하고 정량화하는 대부분의 방법은12,13에필요한 조직의 높은 비용과 양으로 인해 도전적이다. 다중 PTM 농축 실험은 시료 전처리, 데이터 수집 및 데이터 분석 측면에서 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라, 이러한 연구는 전형적으로 크고 종종 금지되는 양의 단백질11을필요로 한다. 여기에 설명된 프로토콜은 여러 PTM의 동시 보강 및 분석을 위한 프로토콜로, 이러한 여러 장벽을 해결하고 다양한 PTM14간의 대규모 PTM 프로파일링 및 평가를 가능하게 합니다. 이 한 냄비 워크플로우는 생물 의학 연구원이 전 세계적으로 여러 PTM을 프로파일화하고, 공동 변형 된 펩티드를 식별하고, 효율적이고 비용 효율적인 방법으로 PTM 누토크를 연구할 수있는 실용적인 방법을설명합니다 14,15.
여기에서, 이 방법은 50 년 전에16년 이상 처음으로 공부된 미토콘드리아 단백질 acylation를 검토하여 전시됩니다. 특히 리신아세틸화(17) 및 간시닐레이션(18)에 집중하며, 단백질에 대한 이러한 변형의 공동 발생을 포함하고 펩티드 수준에서도 공동 변형한다. 이 연구는 sirtuin 5 (SIRT5) 녹아웃 마우스 모델을 사용하기 때문에, 아세틸화 및 침전 부위의 농축에 초점을 맞추기 위해 선택되었다. 이 결정은 succinylation 사이트가 SIRT5 desuccinylase의 표적이기 때문에 이렇게 KO 마우스에 있는 중요한 upregulation를 보여주기 위하여 예상되기 때문에, 그(것)들을 이 경우에 가장 관련성 이 PTM 만들기. 두 PTM은 최근 Carrico et al.19에의해 요약된 바와 같이 생물학적으로 관련이 있습니다. 일반적으로, 아세틸화는 유전자 발현 및 대사에 중요한 효과를 나타내며, 간결화는 심장 대사 및 기능20을조절하는 것으로 보고되었다.
기재된 프로토콜은 적은 양의 단백질 입력 물질(예를 들어, 1 mg의 단백질 용해)으로 수행될 수 있으며 샘플 처리, MS 수집 및 데이터 분석에 소요되는 시간을 감소시킴으로써 실험의 총 기간을 감소시킨다. 워크플로는 그림 1에제공됩니다. 우리는 또한 더 낮은 양의 시작 물질을 사용했습니다 (단백질 용해액의 100 μg까지, 그에 따라 사용되는 비드의 양을 축소), 이는 예상대로, 확인 된 아실화 펩티드의 전반적인 수율을 감소; 그러나, 그것은 여전히 매우 가치있는 결과와 정량화 된 수화물 펩티드를 제공합니다.
소위 하향식 또는 중간 하향 식 워크플로우는 일반적으로 단백질 분해 소화 접근법을 사용하지 않지만 (따라서 하나의 단백질 내에서 여러 PTM의 연결을 유지), 이 프로토콜은 PTM 식별 및 정량화를위한 추가 깊이와 감도를 얻기 위해 펩티드 기반 친화 강화 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다(그림 1). 또한, 이 펩타이드 중심 워크플로우는 1) 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위한 데이터 의존적 수집(DDA) 및 2) 데이터 독립적 수집(DIA)을 포함한 최신 질량 분석 방법을 활용하여 라벨 없는 워크플로우에서 정확한 PTM 정량화를 제공합니다.
DIA 워크플로우는 샘플링된 m/z 범위21내의 모든 펩티드 신호를 포괄적으로 단편화하여 일반적인 DDA 스캔 방식의 샘플링 스토시시티를 극복합니다. 이 기능은 또한 펩티드 내에서 변형되는 특정 단편 이온에 관한 정보를 얻는 것이 더 쉽기 때문에 사이트 국소화 측면에서 매우 유용합니다. 또한 DIA 워크플로우를 통해 동일한 전구체 이온을 가진 경미한 PTM-펩타이드 이소폼을 식별하고 정량화할 수 있습니다. DIA 방법은 또한 항상 포괄적으로 측정되는 특정 상응하는 단편 이온에 기초하여 펩티드 내의 특정 PTM 부위 국소화를 결정할 수 있다. 그러나 DDA 접근 방식은 종종 동일한 전구체 이온에 대해 MS/MS의 다중 샘플링을 제외하는 “동적 배제” 기능을 사용하므로 사소한 PTM 이소폼이 누락됩니다.
여기에 설명된 동시 보강 전략은 여러 PTM의 글로벌 프로파일링 및 정량화, PTM 누화 검사, 번역 후 수정의 동적 상호 작용 이해의 이점을 제공하는 연구에 이상적입니다. 하나의 결합된 워크플로우에서 다중 농축 PTM의 식별은 단백질화 펩타이드를 함유하는 PTM의 글로벌, 직렬 또는 병렬 농축, 또는 본래 단백질의 분석에 의해 대체로 설명되었습니다. 아세틸화 및 간화의 연속 농축과 직접 비교하여, 원팟 방법론의 효율은 매우 유사한 것으로 확립되었다14. 이러한 대체 프로토콜은 상당한 양의 시작 재료와 시간이 필요하며 엄청나게 비쌀 수 있습니다. 대조적으로, 원팟 프로토콜은 후속 분석 및 식별을 통해 하나 이상의 PTM을 농축하는 저렴하고 효율적인 방법을 제공한다.
마우스 간 조직은 SIRT5 녹아웃 마우스로부터 수득되고 여기에서 시작 물질로서 사용된다. 이 프로토콜은 또한 상이한 조직 또는 세포 배양 실험으로부터단백질 용해를 위해 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 조직 또는 세포 배양 펠릿으로부터 수득된 단백질 리세이트에 적용될 수 있다.
이 프로토콜은 PTM 누토크를 보다 효과적으로 이해하기 위해 동시에 다중 PTM 농축을 위한 새로운 기술을 설명합니다. 이 목표에 도달하는 대안적인 방법은 엄청나게 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 경향이 있으며,11,13을성공시키기 위해서는 다량의 단백질이 필요합니다. 이 프로토콜은 실험의 전반적인 효율성을 향상시키기 위해 한 번에 두 개의 PTM에 대한 항체 컨쥬게이션 비드의 인큐베이션을 포함하는 다중 PTM 농축 워크플로우를 제시한다. 이 방법은 또한 스펙트럼 라이브러리 생성 및 DIA MS 획득을 위한 DDA의 사용을 수반하여 단편 이온22,23으로부터의감소된 간섭으로 존재하는 펩티드를 검출하고 정량화한다. MS 데이터베이스 검색 엔진과 같은 소프트웨어 프로그램은 DDA 획득에서 데이터를 분석하고 정량화하는 데 사용되는 반면, 정량적 프로테오믹스소프트웨어(24)와 특정 DIA 정량 분석소프트웨어(25)는 DIA 획득에 의해 생성된 복잡한 스펙트럼을 해석하는 데 필요합니다.
이 프로토콜에는 신중하게 따라야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 프로토콜의 주요 목표는 여러 PTM을 동시에 풍부하게 하는 것이므로, 항체-친화성 농축 단계(섹션 2)는 실험의 성공에 매우 중요하다. 구슬에 세서를 수행 할 때, 구슬중 어느 것도 실수로 흡인되지 않도록할 필요가있다. 트립신(step 1.8)으로 소화되기 전에 우레아 농도를 1M로 희석하는 것도 필요하다. 단백질 용해화를 위한 프로토콜의 초기에 8M 우레아가 요구되더라도, 1 M 이상의 우레아 농도는 트립신의 효소 활성을 억제한다. 또한 프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 pH를 일관되게 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 소화하기 전에 특히 중요합니다. 시료 및 트립신 용액의 pH가 인큐베이션 전에 적절히 중화되지 않으면, 많은 절단 부위가 누락될 수 있는 비효율적인 소화를 초래할 수 있으며, 이로 인해 펩티드 식별이 감소할 수 있다.
샘플을 준비할 때 프로토콜을 약간 수정하면 도움이 될 수 있습니다. 1 mg의 시작 물질로부터 조달된 단백질 용해물의 경우, 각 PTM 스캔 튜브에 제공된 항체 비드의 분기가 비용 효율적인 대안으로 사용될 수 있다. 사용되는 항체 비드의 양이 비례적으로 증가하는 한 더 많은 양의 시작 물질을 더 나은 결과를 위해 사용될 수 있습니다. 워크플로우를 향상시킬 수 있는 또 다른 수정사항은 트립신 이외에 다른 프로테아제로 샘플을 소화하는 것입니다. 이 수정은 단백질 잔기의 증가한 엄호를 제공하는 펩티드 에 있는 더 많은 가변성 귀착될 것입니다. 필요는 없지만, 트립신은 높은 절단 특이성26으로인해 PTM 분석에 사용되는 효소 중 하나가 되는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 한계는 연구 중인 PTM이 동시에14를농축하기 위해 유사한 화학을 가질 필요가 있다는 것입니다. 상이한 항체-컨쥬게이션 비드에 대한 절차는 유사한 용출 조건을 포함하는 유사한 용매 및 용액을 활용하며, 바람직하게는 동일한 공급업체로부터 유사해야 한다. 이러한 이유로, 여기서 설명된 방법은 일관되게 아세틸화 및 간결화를 예로 사용하며, 둘 다 항체 접합비(Cell Signaling Technology, Inc.)를 사용한다. 이 방법은 이론적으로 모든 수의 PTM에 적용될 수 있지만, 이 점에서 프로토콜의 정확한 한계를 평가하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다. 더욱이, 이것은 항체 기반 농축 방법이므로, 상기 방법은 PTM 부위의 상대적 정량화만을 제공할 수 있다.
기존 다중 PTM 보강 방법과 비교하여 이 워크플로는 보다 실현 가능하고 비용 효율적인 대안입니다. 이 실험에서, 이 방법의 효능은 개별 또는 직렬 농축과 같은 대체 방법과 매우 잘 비교된다는 것이 관찰되었다. 도 2B는 변형된 펩티드 피크 영역에 대한 중앙값 CV가 단일 PTM 농축물 및 직렬 PTM 농축물(13)에 비해 단일 포트 방식에서 실제로 감소되었다는 것을 보여준다. 우리는 또한 아세틸화 또는 간결화에 대한 사이트 수준의 정량화를 평가하는 실험 결과를 분석했습니다. 또한, 스피어맨 상관분석(그림 2C,D)은단일 PTM 농축 워크플로우와 유사하게 원팟 PTM 농축이 수행된다는 것을 입증하였다. 이것은 또한 펩티드- 및 단편 수준 상관관계에 대해서도 마찬가지였다. 한 포트와 직렬 PTM 농축을 비교할 때 세 가지 상관 관계에 대해 동일한 관찰이 유지되었습니다.
이 프로토콜을 통해 연구자들은 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 빠르고 비용 효율적인 방식으로 만들 수 있습니다. 워크플로의 DIA 구성 요소는 현장 현지화에 대한 정보를 제공하고 PTM의 낮은 사이트 점유와 같은 문제를 극복하기 때문에 연구원이 PTM에 대해 더 많이 이해할 수 있게 해줍니다. 후속 실험은 이 방법을 사용하여 동시에 보강될 수 있는 PTM 수의 상한을 평가하기 위해 수행될 수 있습니다. 이 워크플로의 향후 개선에는 사이트 지역화 및 PTM 사이트 점유 분석을 더욱 자동화하기 위한 고급 소프트웨어 플랫폼 개발이 포함될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 벅 연구소 (1S10 OD016281)에서 트리플 TOF 시스템에 대한 NIH 공유 계측 보조금의 지원을 인정합니다. 이 작품은 또한 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (R01 AI108255 b.S.) 및 당뇨병과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소 (에릭 베르딘에 R24 DK085610;; R01 DK090242에서 에릭 괴츠만까지). X.X.는 국립 보건원 (NIH 교부금 T32GM8806, 주디스 캄피시 및 리사 엘러비)의 보조금으로 지원되었으며, N.B.는 글렌 의학 연구 재단의 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |