JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

Abstract

Kimyasal ve biyo-konjugasyon teknikleri son yıllarda hızla geliştirilmiş ve protein polimerlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Ancak, kontrollü bir protein polimerizasyon süreci her zaman bir meydan okumadır. Burada, polimerize proteini adım adım rasyonel olarak kontrol edilen bir dizide oluşturmak için enzimatik bir metodoloji geliştirdik. Bu yöntemde, bir protein monomer C-terminus OaAEP1 kullanarak protein çekimi için NGL(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) N-terminus bir dekolte TEV iken (tütün etch virüs) dekolte sitesi artı bir L (ENLYFQ / GL) geçici N-terminal koruma için. Sonuç olarak, OaAEP1 bir seferde sadece bir protein monomer eklemek başardı, ve sonra TEV proteaz NH2-Gly-Leu ortaya çıkarmak için Q ve G arasındaki N-terminus cleaved. Sonra birim sonraki OaAEP1 ligasyon için hazırdır. Tasarlanmış poliprotein atomik kuvvet mikroskobu tabanlı tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (AFM-SMFS) kullanılarak bireysel protein etki alanı açılarak incelenir. Bu nedenle, bu çalışma poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon için yararlı bir strateji sağlar.

Introduction

Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, doğal çok etki alanı proteinleri iyi kontrollü bir sayı ve subdomains1türü ile tek düze bir yapıya sahip. Bu özellik genellikle gelişmiş biyolojik fonksiyon ve kararlılık yol açar2,3. Sistein bazlı disülfür bağı bağlantısı ve rekombinantDNA teknolojisi gibi birçok yaklaşım, birden fazla etki alanı4,5,6,7ile böyle bir polimerize protein oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, eski yöntem her zaman rasgele ve kontrolsüz bir dizi sonuçlanır, ve ikincisi toksik ve büyük boyutlu proteinlerin aşırı ekspresyonu ve kofaktör ve diğer hassas enzimler ile karmaşık protein saflaştırılması için zorluk da dahil olmak üzere diğer sorunlara yol açar.

Bu zorluğu aşmak için, protein monomerini polimer/poliprotein için adım adım bir şekilde bir protein ligaz OaAEP1 ile proteaz TEV8,9ile birleştiren enzimatik bir yöntem geliştiriyoruz. OaAEP1 sıkı ve etkili bir endopeptidazdır. N-terminus Gly-Leu kalıntısı (GL) ise iki protein Kovalent Olarak Asn-Gly-Leu dizisi (NGL) OaAEP1 tarafından iki termini ile 30 dakikadan daha az ve c-terminus NGL kalıntıları10ise bağlanabilir. Ancak, OaAEP1’in sadece protein monomerini bağlamak için kullanılması, sistein bazlı kaplin yöntemi gibi kontrolsüz bir diziye sahip bir protein polimerine yol açar. Bu nedenle, protein ünitesinin N-terminus’unu çıkarılabilir bir TEV proteaz alanı ve enlyfq/G-L-POI olarak bir lösin kalıntısı ile tasarlıyoruz. TEV bölünmesinden önce, N-terminali OaAEP1 ligasyonuna katılmaz. Ve daha sonra N-terminus gl artıkları, hangi daha fazla OaAEP1 ligasyon ile uyumludur, TEV bölünme sonra maruz kalır. Böylece, nispeten iyi kontrol edilen bir dizi ile poliproteinin sıralı enzimatik biyosentez yöntemini elde ettik.

Burada, adım adım enzimatik sentez yöntemimiz, sekans kontrollü ve kontrolsüz dahil olmak üzere poliprotein numune hazırlamada ve özellikle karmaşık sistem için tek moleküllü çalışmalar için protein immobilizasyonunda kullanılabilir. metalloprotein.

Ayrıca, AFM tabanlı SMFS deneyleri bize tek molekül düzeyinde protein polimer inşaat ve istikrar onaylamak için izin verir. AFM, optik cıvık ve manyetik cıvık da dahil olmak üzere tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, biyomolekülü mekanik olarak manipüle etmek ve stabilitelerini ölçmek için nanoteknolojide genel bir araçtır11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Tek moleküllü AFM yaygın protein çalışmasında kullanılmıştır (un)katlama21,22,23,24,25, reseptör-ligandetkileşimininmukavemet ölçümü 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, inorganik kimyasal bağ20,36,37,38,39,40,41,42,43 ve metal-ligand bond metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Burada, tek moleküllü AFM, sentezlenen poliprotein dizisini ilgili protein açılma sinyaline göre doğrulamak için kullanılır.

Protocol

1. Protein üretimi Gen klonu Satın alma genleri ilgi protein için kodlama (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, selüloz bağlayıcı modül (CBM), dockerin-X etki alanı (XDoc) ve Ruminococcus flavefaciencegelen uyum , tütün etch virüs (TEV) protease, elastin-likepeptids (ELP). Polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin ve farklı protein parçalarından geni yeniden birleştirmek için üç restriksiyonsindirim enzim sistemi Ba…

Representative Results

OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilemez, zira açılma kuvveti (<Fu>) ve kontur uzunluğu artış (<ΔLc>) önceki çalışmayla karşılaştırılabilir(Şekil 1). Rubredoksin proteininin arınma sonucu Şekil 2’degösterilmiştir. TEV dekoltesi sonrası proteini kanıtlamak için aşağıdaki OaAEP1 ligasyonu ile uyumlu durarak protein polimerini kont…

Discussion

Enzimatik biyosentez ve poliproteinimmobilizasyonu için bir protokol tanımladık ve afm tabanlı SMFS tarafından poliprotein tasarımını doğruladık. Bu metodoloji, poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon4,6,52, 53,54,55,56,57,58,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 21771103, 21977047), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No) tarafından desteklenmiştir. BK20160639) ve Jiangsu Eyaleti Shuangchuang Programı.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. i. J., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. 生物化学. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O’Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

OaAEP1Enzymatic SynthesisPolymerized ProteinSingle-molecule Force SpectroscopyProtein OligomerPolymerization DegreeProtein-based MaterialCysteinePotassium ChromateSulfuric AcidAPTESSulfo-SMCCGL-ELP-50 Cys-proteinCantilever Surface

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image