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生物化学

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Abstract

Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introduction

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método anterior sempre resulta em uma sequência aleatória e descontrolada, e o último leva a outros problemas, incluindo a dificuldade para a superexpressão de proteínas tóxicas e de grande porte e a purificação de proteínas complexas com cofator e outras enzimas delicadas.

Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um método enzimático que conjuga monomer proteático em conjunto para polímero/poliproteína de forma stepwise usando uma proteína ligase OaAEP1 combinada com um TEV 8protease,9. OaAEP1 é uma endopeptidase rigorosa e eficiente. Duas proteínas podem ser ligadas covalentemente como sequência Asn-Gly-Leu (NGL) através de dois termini por OaAEP1 em menos de 30 min se o N-terminus for resíduos Gly-Leu (GL) e a outra do qual o terminal C é resíduos NGL10. No entanto, o uso do OaAEP1 apenas para ligar o monômero de proteína leva a um polímero proteico com uma sequência descontrolada como o método de acoplamento à base de cisteína. Portanto, projetamos o N-terminus da unidade proteica com um local protease TEV removível mais um resíduo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes do decote TEV, o n-terminal não participaria da ligadura OaAEP1. E então os resíduos GL no N-terminus, que são compatíveis com a ligadura OaAEP1, são expostos após o decote TEV. Assim, alcançamos um método sequencial de biosíntese enzimática de poliproteína com uma sequência relativamente bem controlada.

Aqui, nosso método de síntese enzimática stepwise pode ser usado na preparação de amostras de poliproteína, incluindo controlado por sequência e descontrolado, e imobilização proteica para estudos de moléculaúnica também, especialmente para o sistema complexo, como metaloproteína.

Além disso, os experimentos de SMFS baseados em AFM nos permitem confirmar a construção e estabilidade do polímero de proteína no nível de uma única molécula. A espectroscopia de força de molécula única, incluindo AFM, pinça óptica e pinça magnética, é uma ferramenta geral na nanotecnologia para manipular a biomolécula mecanicamente e medir sua estabilidade11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. A AFM de molécula única tem sido amplamente utilizada no estudo da proteína (un)dobrável21,22,23,24,25, a medida de força do receptor-ligand interação26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, ligação química inorgânica20,36,37,38,39,40,41,42,43e metal-ligand vínculo em metaloproteína44,45,46,47,48,49, 50 . Aqui, a AFM de uma única molécula é usada para verificar a sequência de poliproteína sintetizada com base no sinal de desdobramento da proteína correspondente.

Protocol

1. Produção de proteínas Clone genético Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs). Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restri…

Representative Results

Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (<Fu>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte li…

Discussion

Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
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