Quantification des niveaux d’éthanol dans les embryons de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de tête
Summary
Ce travail décrit un protocole pour quantifier les niveaux d’éthanol dans un embryon de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête à partir de méthodes d’exposition appropriées au traitement des embryons et à l’analyse de l’éthanol.
Abstract
Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un continuum très variable de défauts développementaux induits par l’éthanol, y compris les dysmorphologies faciales et les déficiences neurologiques. Avec une pathologie complexe, l’ETCAF touche environ 1 enfant sur 100 né aux États-Unis chaque année. En raison de la nature très variable de l’ETCAF, les modèles animaux se sont avérés essentiels dans notre compréhension mécaniste actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Un nombre croissant de laboratoires se sont concentrés sur l’utilisation du poisson zèbre pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol. Les poissons zèbres produisent un grand nombre d’embryons fécondés, génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques et de quantifier l’impact de l’exposition à l’éthanol embryonnaire grâce à des techniques d’imagerie en direct. Ceci, combiné avec le degré élevé de conservation de la génétique et du développement avec l’homme, s’est avéré le poisson zèbre pour être un modèle puissant dans lequel étudier la base mécaniste de la tératogénicité d’éthanol. Cependant, les schémas d’exposition à l’éthanol ont varié entre les différentes études sur le poisson zèbre, ce qui a confondu l’interprétation des données sur le poisson zèbre dans ces études. Voici un protocole pour quantifier les concentrations d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête.
Introduction
Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un large éventail de déficiences neurologiques et de dysmorphologies craniofaciales associées à l’exposition à l’éthanol embryonnaire1. De multiples facteurs, y compris le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol et le bagage génétique, contribuent à la variation de l’ETCAF2,3. Chez l’homme, la relation complexe de ces variables rend difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF. Les modèles animaux se sont avérés cruciaux dans le développement de notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol. Une grande variété de systèmes de modèles animaux a été utilisé pour étudier de multiples aspects de l’ETCAF et les résultats ont été remarquablement compatibles avec ce qui se trouve dans l’exposition chez l’homme4. Les systèmes modèles de rongeurs sont utilisés pour examiner de nombreux aspects de l’ETCAF, avec des souris étant les plus communs5,6,7. La majorité de ces travaux ont porté sur les défauts de développement à l’exposition précoce à l’éthanol8, bien que l’exposition ultérieure à l’éthanol a été montré pour causer des anomalies du développement ainsi9. En outre, les capacités génétiques des souris ont grandement aidé dans notre capacité à sonder les fondements génétiques de l’ETCAF10,11. Ces études chez la souris suggèrent fortement qu’il existe des interactions gènes-éthanol avec la voie du hérisson sonore, la signalisation acide rétinoïque, Superoxide dismutase, oxyde nitrique synthase I, Aldh2 et Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Ces études montrent que les modèles animaux sont essentiels pour faire progresser notre compréhension de l’ETCAF et de ses mécanismes sous-jacents.
Le poisson zèbre a émergé comme un système modèle puissant pour examiner de nombreux aspects de la tératogenèse de l’éthanol22,23. En raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur région génétique et de leurs capacités d’imagerie vivante, le poisson zèbre est idéal pour étudier des facteurs tels que le moment, la posologie et la génétique de la tératogénèse à l’éthanol. L’éthanol peut être administré à des embryons mis en scène avec précision et les embryons peuvent ensuite être représentés pour examiner l’impact direct de l’éthanol pendant les processus de développement. Ce travail peut être directement lié à l’homme, parce que les programmes génétiques de développement sont fortement conservés entre le poisson zèbre et l’homme et peuvent donc aider à guider les études humaines de l’ETCAF24. Alors que le poisson zèbre a été utilisé pour examiner la tératogénèse à l’éthanol, un manque de consensus dans la déclaration des concentrations d’éthanol embryonnaire rend la comparaison avec les humains difficile25. Dans les systèmes de mammifères, les niveaux d’alcool dans le sang sont directement corrélés aux niveaux d’éthanol tissulaire26. Bon nombre des études sur le poisson zèbre traitent les embryons avant la formation complète de leur système circulatoire. En l’absence d’échantillon maternel à examiner, un processus d’évaluation des concentrations d’éthanol est nécessaire pour quantifier les niveaux d’éthanol à l’intérieur de l’embryon. Ici nous décrivons un processus pour quantifier des concentrations d’éthanol dans un embryon en développement de poisson zèbre utilisant la chromatographie de gaz d’espace de tête.
Protocol
Representative Results
Discussion
En tant que modèle de développement, le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact des facteurs environnementaux sur le développement. Ils produisent un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur, ce qui permet un moment précis et des paradigmes de dosage dans les études sur l’éthanol. Ceci, combiné avec les capacités d’imagerie en direct et la conservation génétique et développementale avec les humains, font du poisson zèbre un puissant système modèle pour les études de tératologi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche présentée dans cet article a été soutenue par des subventions antérieures des National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 à J.K.E. et National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. et par la subvention actuelle des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Nous remercions Rueben Gonzales d’avoir fourni et aidé à l’analyse des chromatographes à gaz. Nous remercions Tiahna Ontiveros et la Dre Gina Nobles.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
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