实验进化方法中疟原虫介导抗生素耐药性的定量化

1. 构建携带抗生素抗药性基因的质粒模型 注：大肠杆菌菌株K-12 MG1655在所有实验中用作模型有机体（DSM No. 18039，德国微生物和细胞培养集合，DSMZ）。大肠杆菌DH5®17菌株在质粒结构过程中使用。 PCR通过PCR放大您选择的质粒主干，并扩增包括启动子区域在内的抗性基因（图1）。 PCR使用高保真聚合酶和寡核苷酸pBBR1_for（5′-GCGGCCACCCTCTGCT-3’）和pBBR1_rev（5′-TACGCGCGCGCGCGCGCCCC-3’）在质粒模板pLC上放大质粒主干（GenBankc.no.MH238456）18. PCR扩增抗性基因nptII，包括原生Tn5启动剂19，使用高保真聚合酶和寡核苷酸nptII_gib_for（5′-GCGCCGATATATATATATATATATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCCGCGCA-3’）和nptII_gib_rev（5′-CGGGGCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAAAAGAGAG-3）。nptII基因编码为新霉素磷酸转移酶，并赋予卡那霉素的抗药性。注：设计抗性基因的引源，其补充序列约为20 bp，与质粒主干进行融合。 使用您选择的套件清洁两个 PCR 片段。 将纯化抗生素抗性基因PCR产物（包括其启动子区域）加入纯化质粒骨干，并使用等温组装20将同源区融合，在50°C下60分钟。 将熔融产物电化到大肠杆菌DH5+菌株中。 在4°C和2.5 kV下，在2mm比色皿中引入2μL产品，从步骤1.3引入40μL电能电池。在1 mL的合温合意汤（LB）培养基中重新悬浮细胞。 将总体积转移到微电管，在37°C下在轨道摇床中以250rpm摇动孵育1小时，以允许在质粒上表达电阻标记。 含有适当抗生素（卡那霉素25微克/mL）的LB琼脂板上的细胞板100μL，用于选择抗生素抗性基因，从而选择携带质粒的细胞。向下旋转其余部分，去除上清液，将细胞重新悬浮在100 μL LB中，并在选择性琼脂板上固定。在37°C下孵育板24小时。 为了验证克隆，使用商业小型制备试剂盒通过碱性解结提取构建的质粒。 在室温下在12，000 x g下离心，收获5 mL的固定过夜培养物。在重新悬浮溶液中重新悬浮细胞，然后赖舍和中和细胞溶液。在12，000 x g下离心5分钟。 将上清液转移到试剂盒中提供的DNA结合柱上，用500μL洗涤溶液离心2倍洗涤柱两次，然后再用洗脱缓冲液洗脱柱膜。 对质粒执行桑格测序，以确认序列正确。 一旦质粒的有效性得到验证，电化质粒（现在pCON）到菌株大肠杆菌MG1655如上所述。这产生菌株大肠杆菌MG1655 pCON。 2. 监测不同条件下携带质粒的细菌 注：在两种温度（37°C和20°C）和三个种群瓶颈尺寸下，在非选择性条件下（LB介质）下进行质粒携带菌株的进化实验。实验设计用于研究各种条件下的质粒持久性。 设计一个进化实验，以随时间变化来跟踪质粒频率 （图2） 在LB琼脂板上将构建的质粒携带菌株（大肠杆菌MG1655 pCON）板板，辅以抗生素（卡那霉素25微克/mL），并在37°C孵育过夜。 在每口井中准备 96 个深孔板，每口孔中具有 1 mL 的 LB 介质。作为细菌祖先，从独立井中的琼脂板中随机分离的菌落。在板摇架上以37°C和450rpm的速度孵育板24小时。制备祖传克隆的冷冻甘油库存。 第二天，根据实验设计，将8个复制种群转移到新的深井板中（图2）。培养物被稀释 1：100 （大瓶颈， L）， 1：1，000 （中等瓶颈， M）， 或 1：10，000 （小瓶颈， S） 的总体积 1 mL LB 使用 PBS 稀释.稀释的培养物在37°C和20°C孵育。注：控制 96 深孔板中的交叉污染非常重要。因此，使用棋盘板设计，使用无细菌LB介质中插气孔。在整个进化实验中使用此模式。 在37°C孵育的培养物每12小时转移一次，20°C的培养物每24小时转移一次。注：在每个传输事件中，将应用瓶颈大小处理，并在总共 98 次传输中重复进行串行传输。传输的数量将取决于读者的实验设计。 定期准备所有人群的冷冻甘油库存，每周2次。 通过复制电镀监测质粒频率 （图 3）注：在进化实验中，从宿主的比例估计种群中携带质粒的细胞频率。复制电镀协议如图3所示。 为了确定进化实验期间种群中的质粒频率，固定培养物被连续稀释，并在非选择性LB琼脂板上镀上。根据每盘250-500个菌落的收率调整稀释。注：在电镀之前准备厚LB琼脂板（±30 mL琼脂）。 在实验中，镀层人群根据生长温度孵育一夜生长。注：菌落需要小，因此在37°C下孵育<24 h。 在一夜的生长后，使用手动或自动菌落计数站计算所有菌落，并计算培养物中细菌总种群大小。注：琼脂板边缘的菌落不应包含在细菌细胞总数中。 通过高压灭菌对棉绒的方形件（约20 x 20厘米）进行消毒。注：天鹅绒布需要100%棉才能高压灭。消毒后干燥布很重要。 对天鹅绒布进行灭菌后，将布放在圆块上，用金属环固定。避免皱纹至关重要。小心地将种植的菌落（琼脂朝下）放在固定天鹅绒布表面上。通过小心地按圆形敲击培养皿，确保所有菌落接触天鹅绒表面。 小心地取出 LB 琼脂板，并将一个辅以抗生素（卡那霉素 25 μg/mL）的选择性板放在天鹅绒布上。确保盘子接触所有的天鹅绒，仔细敲击培养皿，如前所述。之后，取出板。将盘子放在室温下，进行过夜生长。 第二天，评估LB琼脂板和选择性板。在选择性培养基上生长的菌落被计为质粒宿主（即抗生素耐药），而无菌落的菌落是无质粒的菌落，因此对抗生素没有抗药性（即，失去质粒）。这是通过将盘子放在彼此上，并比较生长（即标记任何丢失的殖民地）和计算两个板块上的菌群编号来完成的。这会产生在进化实验中失去质粒的细胞数量。 定期对整个进化实验重复此过程（例如，每 14 次传输）。 3. 使用凝胶电泳对质粒多体体的可视化 注：低拷贝质粒的质粒提取通常会导致宿主染色体DNA的污染，在可视化之前需要酶消化。 使用碱性解结从5 mL固定过夜细胞培养中提取质粒DNA，如步骤1.5所述。 之后，使用ATP依赖的DNase处理提取的质粒DNA，这种DNA只切割染色体DNA，以消除染色体DNA污染（见材料表）。在37°C孵育30分钟。之后，使用您选择的试剂盒清洁DNA。 要创建所有质粒合构体的开放圆分子（单体或多子体），使用刻痕酶（Nb.BsrDI）孵育质粒DNA样本，并在65°C孵育30分钟。 同时，要创建线性质粒分子（即，用于质粒大小比较），请使用您所选择的限制酶（例如 HindIII），将质粒切割一次。注：这导致线性DNA质粒单体。开放圆分子不会以线性方式迁移。 为了可视化质粒的大小和构象，电噬120分钟的刻痕和线性质粒DNA样本，在4.3 V/cm的1%（w/v）角质凝胶和1°TAE缓冲液中。样品被染色的米多里绿色和凝胶可视化在凝胶成像系统（见材料表）。使用 1 kbp 梯子。