哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

コレステロールは、主要な細胞脂質、多数の重要な機能的および構造的役割^{11、2、3、4、5、6、7、8、92,3,4,5,6,7,8を9}果たしている。原形質膜の物理的性質を調節することから、細胞の生存率を保証すること、増殖、増殖、および生化学的経路の多くのシグナル伝達および前駆体分子としての役割を果たすことまで、コレステロールは正常な細胞および器官機能に必要不可欠な構成要素である。その結果、コレステロール欠乏症は、重度の身体的奇形および様々な障害をもたらす。^,一方、生理学的レベル(2-3x)以上のコレステロールのわずかな増加でさえ、細胞傷害性^{,11、2、102,10}であり、心血管^11、12、13および神経変性疾患^{111414、15、16、1715}を含む障害の発症と関連している。^16,171213このように、コレステロールの重要な機能を問い合わせて、コレステロール値の変化の影響を判断するために、組織、細胞、およびゼノプス卵母細胞中のコレステロールの含有量を変化させる異なるアプローチが開発されている。

哺乳類組織および細胞におけるコレステロール値の変化
いくつかのアプローチは、組織および細胞¹⁸におけるコレステロールのレベルを低下させるために利用することができる。1つのアプローチは、コレステロール合成^19,20の速度を制御するHMG-CoA還元体を阻害するためにリポタンパク質欠損血清中に溶解したスタチンへのそれらの曝露^を20含む。しかし、これらのコレステロール低下薬はまた、メバロント経路に沿った非ステロール製品の形成を阻害する。したがって、これらの製品²¹の形成を可能にし、このアプローチの特異性を高めるために少量のメバロン化物が添加される。コレステロール値を低下させるもう一つのアプローチは、β-シクロデキストリンの使用を含む.これらのグルココピー鼻モノマーは、ステロール²²の大きさに一致する直径を有する内部疎水性キャビティを有し、細胞からのコレステロールの抽出を容易にし、それによってそれらの天然コレステロール含有量²³からそれらを枯渇させる。その一例は、2−ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン(HPβCD)であり、ニーマンピック型C型疾患の治療のために現在試験されている前臨床薬物であり、リソソームコレステロール貯蔵²⁴を特徴とする遺伝的に遺伝した致命的な代謝障害である。コレステロールの枯渇のレベルは、使用される特定の誘導体に依存します。例えば、HPβCDはメチル化誘導体よりも低容量のコレステロールを抽出し、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)24、25、26、27、28、29、30。^{29,3024,25,26,27,28,}しかし、特に、β-シクロデキストリンはコレステロールに加えて他の疎水性分子を抽出することもできるが、その後、非特異的な効果^{を生じ得る31。}枯渇とは対照的に、細胞および組織は、コレステロール²³で予備飽和されたβ-シクロデキストリンによる処置を通じてコレステロールを特異的に濃縮することができる。このアプローチは、コレステロール枯渇³¹に用いられるβ-シクロデキストリンの特異性のコントロールとして用いることもできる。組織および細胞からのコレステロールの枯渇は簡単であり、細胞を貯蔵するために使用される培地に溶解した30〜60分間mMMβCDの細胞を曝露することによって達成することができる。このアプローチは、コレステロール含有量の50%の減少をもたらすことができます(例えば、海馬ニューロン^32、ラット大脳動脈^33)。一方、組織や細胞のコレステロール濃縮のためのβ-シクロデキストリン-コレステロール複合体の調製はより複雑であり、プロトコルセクションに記載される。

コレステロールを飽和させたβ-シクロデキストリンを用いて組織および細胞を濃縮する別のアプローチは、組織/細胞¹⁸に発現するLDL受容体に依存するLDLの使用を含む。このアプローチは、細胞の天然コレステロール恒常性機械を使用する利点を提供するが、それはいくつかの制限があります。第一に、LDL受容体を発現しない組織や細胞は、このアプローチでは濃縮できない。第二に、LDL粒子はコレステロールに加えて他の脂質を含む。具体的には、LDLは、タンパク質ApoB_100(25%)で構成されています以下の脂質(75%):〜6〜8%コレステロール、〜45〜50%コレステリルエステル、〜18〜24%リン脂質、および〜4〜8%トリアシルグリセロール^34。したがって、LDL粒子を介したコレステロールの送達は非特異的である。第三に、LDL受容体を発現する組織および細胞におけるLDLによるコレステロール含有量の増加の割合は、コレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて観察された増加よりも有意に低い場合がある。例えば、以前の研究では、LDLを介してコレステロールを有するげっ歯類の大脳動脈の濃縮は、コレステロール値の10〜15%の増加^{をもたらした35.}対照的に、プロトコルセクションに記載されているようにコレステロールで飽和したシクロデキストリンを有するこれらの動脈の濃縮は、コレステロール含有量の50%の増加をもたらした(代表結果セクション、図1を参照)。

ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール値の変化
ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に一般的に使用される異種発現系を構成する。以前の研究では、ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール対リン脂質モル比は0.5±0.1³⁶であることを示している。コレステロールのこの本質的な高レベルのため、このシステムでコレステロールの含有量を増加させることは困難であり、まだ膜リン脂質とコレステロールから作られた分散を使用して達成することができます。この目的のために選択したリン脂質は、人工平坦脂質二重層の形成に使用されるものと類似しており、L-α-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)および1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-l-セリン(POPS)を含む。この方法では、コレステロールの含有量が 50% 増加する可能性があります (代表的な結果セクションを参照してください(図 2)。

リン脂質ベースの分散液でゼノプス卵母細胞を濃縮する別のアプローチは、組織および細胞が濃縮される方法に似ているコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用を含む。しかし、このアプローチは、コレステロール含有量の平均約25%の増加で、再現性と効率が低いことがわかりました。これは、これら 2 つのアプローチの負荷容量が異なる可能性があります (代表的な結果セクション、図 3を参照)。これに対し、ゼノプス卵母細胞からコレステロールを枯渇させるシクロデキストリンを使用すると、コレステロール含量が36%〜40%減少³⁶する可能性があることが示されている。

ここでは、コレステロール飽和シクロデキストリンの適用と、リポソームを用いたゼノプス卵母細胞の適用を通じて、哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮に焦点を当てます。両方のアプローチは、タンパク質機能に対するコレステロールの増加レベルの効果を示すために利用することができます。タンパク質機能のコレステロール調節のメカニズムは、直接的な相互作用を伴うこと^{があります 8}および/または間接的な効果⁹.コレステロールが直接相互作用を介してタンパク質機能に影響を与える場合、コレステロール値の増加がタンパク質活性に及ぼす影響は、細胞の種類、発現系、または濃縮アプローチとは無関係である可能性が高い。例えば、心房筋細胞37、³⁹海馬ニューロン^{32、38、HEK2933,38細胞}、およびゼノプス卵母細胞^32,37において発現される内向きに整流されたG-gatedG-gated(GIRK)チャネルに対するコレステロールの影響を決定するために^、37これら2つのアプローチを利用した。これらの研究で得られた結果は一貫していた:哺乳類細胞のすべての3つのタイプおよび両生類卵母細胞でコレステロールアップレギュレートGIRKチャネル関数(海馬ニューロンおよびゼノプス卵母細胞における対応する実験については、代表的な結果セクション、図4を参照)。さらに、これらの研究で行われた観察はまた、心房筋細胞^37、40および海馬ニューロン^4032、38,38で行われた研究の結果と一致した高コレステロール食^,40を受けた動物から新たに単離した。特に、MβCDを用いた海馬ニューロンのコレステロール濃縮は、コレステロール値及びGIRK機能³⁸に対する高コレステロール食の影響に対処するために用いられるアトルバスタチン療法の効果を逆転させた。他の研究では、ゼノプス卵母細胞およびHEK293細胞⁴¹の両方を用いて、内向きに整流カリウムチャネルKir2.1のコレステロール感受性に対する突然変異の影響を調べた。繰り返しますが、チャネルの感受性に対する突然変異の影響は、2つのシステムで同様であった。

コレステロール値上昇が分子、細胞、臓器機能に及ぼす影響を判定するための両方の濃縮方法の応用は数多くある。特に、細胞や組織を豊かにするシクロデキストリン-コレステロール複合体の使用は、その特異性が大きく広がることが多い。このアプローチの最近の例としては、HERGチャネル活性化及び基礎機構⁴²に対するコレステロールの影響の決定、コレステロールがヘッジホッグシグナル伝達⁴³を促進するためにSmoothenedGタンパク質結合受容体Smoothenedを活性化するという発見、および膜関連リンカータンパク質⁴⁴を介した幹細胞バイオメカニクスおよび有分形成におけるコレステロールの役割の同定を含む。私たち自身の研究では、MβCD:コレステロール複合体を用いた哺乳類組織濃縮を利用して、コレステロールの富化が血管平滑筋^35,45,46,の大きな導電度(BK,MaxiK)のカルシウムおよび電圧ゲートチャネルの基本的機能^35,および薬理学的プロファイルに及ぼす影響を研究しました。⁴⁶他の研究では、コレステロールを伴う^,ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのリン脂質ベースの分散アプローチを用いて、コレステロール感受性^{41、47、48、49,47,48}におけるKir2.1およびGIRKチャネルにおける異なる領域の役割を決定し、ならびに⁴⁹これらのチャネル32、50、51において^32,50,51コレステロール結合部位を決定した。