העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

כולסטרול, השומנים הסלולר העיקריים, משחק תפקידים קריטיים מבניים רבים^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. מתוך ויסות התכונות הפיזיות של קרום הפלזמה כדי להבטיח את הכדאיות התאית, צמיחה, התפשטות, והגשה כמולקולה איתות ו קודמן בשפע של מסלולים ביוכימיים, כולסטרול הוא רכיב חיוני הכרחי תאים תא נורמלי הפונקציה. כתוצאה מכך, חוסר כולסטרול תוצאות מומים פיזיים חמורים מגוון רחב של הפרעות. מצד שני, אפילו עלייה קטנה בכולסטרול מעל רמות פיזיולוגיות (2-3x) הוא ציטוטוקסי1^1,2,10 והוא נקשר עם פיתוח של הפרעות, כולל לב וכלי דם^11,12,13 מחלות נוירוניווניות^14,15,16,17. כך, כדי לחקור את הפונקציות הקריטיות של כולסטרול כדי לקבוע את ההשפעה של שינויים ברמות הכולסטרול, גישות שונות המשנות את התוכן של כולסטרול ברקמות, תאים, ו- Xenopus oocytes פותחו.

שינוי ברמות הכולסטרול ברקמות ובתאים של היונקים
מספר גישות ניתן לרתום כדי להקטין את רמות הכולסטרול ברקמות ובתאים¹⁸. גישה אחת כרוכה החשיפה שלהם כדי סטטינים התפרקה ליפופרוטאין סרום לקויה לעכב hmg-CoA רדוקטאז, אשר שולטת על שיעור סינתזה כולסטרול^19,20. עם זאת, אלה תרופות הפחתת כולסטרול גם לעכב את היווצרות של מוצרים שאינם sterol לאורך השביל mevalonate. לכן, כמות קטנה של mevalonate מתווסף כדי לאפשר היווצרות של מוצרים אלה²¹ ולשפר את הספציפיות של גישה זו. גישה נוספת להפחתת רמות הכולסטרול כרוכה בשימוש בβ-ציקלודטרינים. אלה ונומרים מונודורים בעלי חלל הידרופובי פנימי עם קוטר המתאים לגודל של תחום ה סטרולים²², אשר מקלה על החילוץ של כולסטרול מתאים, ובכך מכלה אותם מתוכן כולסטרול יליד שלהם²³. דוגמה היא 2-הידרוקסיל-β-cyclodextrin (HPβCD), תרופה פרה-קלינית הנבדקת כיום לטיפול במחלת מחלת הבחור הנימן, הפרעת מטבולית קטלנית תורשתית המאופיינת באחסון כולסטרול ליזוזומבית²⁴. רמת המחסור בכולסטרול תלויה בנגזרת הספציפית שבשימוש. לדוגמה, HPβCD מחלצת כולסטרול בקיבולת נמוכה יותר מאשר הנגזרת המתיל, הβ-cyclodextrin (MβCD)^{24,25,26,27,28,29,30}. בעיקר, עם זאת, β-ציקלודטרינים יכולים גם לחלץ מולקולות הידרופובי אחרים בנוסף לכולסטרול, אשר עשוי לגרום להשפעות שאינן ספציפיות³¹. בניגוד דלדול, תאים ורקמות יכול להיות מועשר במיוחד עם כולסטרול באמצעות הטיפול עם β-cyclodextrin כי כבר presaturated עם כולסטרול²³. גישה זו יכולה לשמש גם כשליטה על הספציפיות של β-ציקלודטרינים המשמשים למחסור בכולסטרול³¹. דלדול כולסטרול מן הרקמות והתאים הוא פשוט יכול להיות מושגת על ידי חשיפת התאים עבור 30-60 דקות כדי 5 mM MβCD מומס במדיום המשמש לאחסון התאים. גישה זו יכולה לגרום לירידה של 50% בתוכן כולסטרול (למשל, ב נוירונים בהיפוקמפוס³², העורקים המוח מוחין³³). מצד שני, הכנת מורכבות β-cyclodextrin-כולסטרול עבור העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מורכבים יותר, והוא יתואר בסעיף הפרוטוקול.

גישה חלופית להעשרת רקמות ותאים באמצעות β-cyclodextrin רווי כולסטרול כרוך בשימוש LDL, אשר מסתמך על קולטני LDL המבוטא ברקמות/תאים¹⁸. בעוד גישה זו מציעה את היתרון של שימוש במנגנון הומאוסטזיס כולסטרול טבעי של התא, יש לו מספר מגבלות. ראשית, רקמות ותאים שאינם מבטאים את קולטן ה-LDL לא ניתן להעשיר באמצעות גישה זו. שנית, חלקיקי LDL מכילים שומנים אחרים בנוסף לכולסטרול. באופן ספציפי, LDL מורכב חלבון ApoB₁₀₀ (25%) ואת השומנים הבאים (75%): ~ 6-8% כולסטרול, ~ 45-50% cholesteryl אסתר, ~ 18-24% פוספוליפידים, ו ~ 4-8% triacylglycerols³⁴. כך, משלוח של כולסטרול באמצעות חלקיקי LDL הוא לא ספציפי. שלישית, אחוז העלייה בתוכן כולסטרול על-ידי LDL ברקמות ובתאים המבטאים את קולטן ה-LDL עשוי להיות נמוך באופן משמעותי מהעלייה שנצפתה באמצעות cyclodextrin רווי בכולסטרול. למשל, במחקר הקודם, העשרה של עורקים מוחין מכרסמים עם כולסטרול דרך LDL הביא רק 10-15% עלייה ברמות הכולסטרול³⁵. לעומת זאת, העשרת העורקים הללו עם cyclodextrin רווי כולסטרול כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול הביאו לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגים, איור 1).

שינוי של רמות כולסטרול בקסנפוס אוציטים
קסנפוס אוציטים מהווים מערכת ביטוי הטרוולוגי המשמשת בדרך כלל לחקר תאי וחלבון. מחקרים מוקדמים הראו כי הכולסטרול ליחס פוספוליפיד טוחנת ב Xenopus oocytes הוא 0.5 ± 0.1³⁶. בשל רמה גבוהה פנימית של כולסטרול, הגדלת התוכן של כולסטרול במערכת זו הוא מאתגר, עדיין ניתן להשיג באמצעות דיספרסיות ממברנה פוספוליפידים וכולסטרול. פוספוליפידים כי בחרנו למטרה זו דומים לאלה המשמשים ליצירת השומנים מישורי מלאכותי bilayers וכוללים L-α-פוספולידילטנולטואמין (האפיפיור) ו-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-פוספאו-L-סרין (פופס), כמתואר בסעיף הפרוטוקול. גישה זו יכולה לגרום לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגות, איור 2).

גישה חלופית כדי להעשיר Xenopus מועשר עם מפזרים פוספוליפיד זרחן כרוך בשימוש של cyclodextrin רווי כולסטרול, אשר דומה הרקמות והתאים מועשרים. עם זאת, מצאנו את הגישה הזאת כדי להיות בלתי מנוצחת ויעילות נמוכה, עם ממוצע של ~ 25% עלייה בתוכן כולסטרול. ייתכן שהדבר נובע מיכולת הטעינה השונה של שתי גישות אלה (ראה סעיף ‘ תוצאות מייצגות ‘, איור 3). לעומת זאת, זה הוכח כי באמצעות cyclodextrin כדי לרוקן את הכולסטרול מ Xenopus oocytes יכול לגרום ~ 40% ירידה בתוכן כולסטרול³⁶.

כאן, אנו מתמקדים העשרה כולסטרול של רקמות ותאים באמצעות היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול, ו Xenopus אוציטים באמצעות ליפוזומים. שתי הגישות ניתן לרתום כדי להתוות את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול על תפקוד החלבון. המנגנונים של אפנון כולסטרול של פונקציית חלבון עשויים לכלול אינטראקציות ישירות⁸ ו/או אפקטים עקיפים⁹. כאשר הכולסטרול משפיע על תפקוד החלבון באמצעות אינטראקציות ישירות, ההשפעה של גידול ברמות הכולסטרול על פעילות החלבון היא כנראה עצמאית של סוג התא, מערכת הביטוי, או גישה העשרה. לדוגמה, אנו מנוצל שתי גישות אלה כדי לקבוע את ההשפעה של כולסטרול ב-G-חלבון מגודרת בתוכו אשלגן (girk) ערוצים מבוטא פרפור מייציטים³⁷, היפוקמוניות נוירונים^32,38, HEK293³⁹ תאים, ו xenopus oocytes^32,37. התוצאות שהתקבלו במחקרים אלה היו עקביים: בכל שלושת הסוגים של התאים המיונקים ובתוך הכולסטרול האמפיבי הכולסטרול של הערוץ (ראה מדור תוצאות נציג, איור 4, עבור נוירונים היפוקמאל והניסויים המתאימים xenopus oocytes). יתר על כן, תצפיות שנעשו במחקרים אלה היו גם עקבי עם תוצאות המחקרים שבוצעו ב פרפור מייציטים^37,40 ו היפוקמאל נוירונים^32,38 מבודדים טרי מבעלי חיים נתון דיאטה כולסטרול גבוה⁴⁰. בעיקר, העשרה כולסטרול של נוירונים היפוקמאל באמצעות MβCD הפך את ההשפעה של טיפול atorvastatin המשמש לטיפול ההשפעה של הדיאטה הכולסטרול הגבוה הן על רמות כולסטרול ו-GIRK פונקציה³⁸. במחקרים אחרים, חקרנו את ההשפעה של מוטציות על רגישות כולסטרול של מבפנים לתקן אשלגן לתקן את קיר 2.1 באמצעות שניהם Xenopus oocytes ו HEK293 תאים⁴¹. שוב, השפעת המוטציות על רגישות הערוץ הייתה דומה בשתי המערכות.

היישומים של שתי שיטות העשרה לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב הם רבים. בפרט, השימוש של מתחמי cyclodextrin-כולסטרול כדי להעשיר את התאים והרקמות הוא נפוץ מאוד בעיקר בשל הייחוד שלה. דוגמאות אחרונות של גישה זו כוללות את קביעת ההשפעה של כולסטרול על הפעלת ערוץ HERG ומנגנונים הבסיסי⁴², גילוי כי כולסטרול מפעיל את חלבון G מצמידים קולטן Smoothened כדי לקדם קיפוד איתות⁴³, ואת הזיהוי של התפקיד של כולסטרול בביומכניקה של תא גזע ו אדיפוגנזה באמצעות רפידת מקשר הקשורים חלבונים⁴⁴. בעבודתנו שלנו, אנו מנוצלים העשרה רקמות המסיביות עם MβCD: קומפלקס כולסטרול כדי ללמוד את ההשפעה של העשרה כולסטרול על הפונקציה הבסיסית ואת פרופיל פרמקולוגית של סידן, מתח מגודרת ערוצים של מוליכות גדולה (BK, מקסימינק) בשריר חלק וסקולרית^35,45,46. במחקרים אחרים, השתמשנו הגישה מבוססי פוספוליפיד מבוסס פיזור עבור מעשיר xenopus של הכולסטרול עם כולסטרול כדי לקבוע את התפקידים של אזורים שונים ב-קיר 2.1 ו-girk של הרגישות כולסטרול^41,47,48,49, כמו גם כדי לקבוע אתרים כולסטרול בכבלים הללו בערוצים אלה^32,50,51.