哺乳动物组织和异种卵母细胞与胆固醇的丰富

胆固醇是一种主要的细胞脂质，它起着许多关键的功能和结构作用¹²1，2，3，4，5，6，7，8，9。^{7,8,95,6,,3,4,,}从调节血浆膜的物理特性到确保细胞的生存能力、生长、增殖，以及作为信号和前体分子在大量生化途径中，胆固醇是正常细胞和器官功能所必需的必要组成部分。因此，胆固醇缺乏会导致严重的身体畸形和各种疾病。另一方面，即使胆固醇在生理水平（2-3x）以上略有增加，也含有细胞毒性^{11、2、10，2,10}与疾病的发展有关，包括心血管^{11、12、1312,13}和神经退行性疾病¹¹14、15、16、17。^14,15,16,17因此，为了询问胆固醇的关键功能并确定胆固醇水平变化的影响，已经开发出了改变组织、细胞和异种卵母细胞中胆固醇含量的不同方法。

哺乳动物组织和细胞中胆固醇水平的变化
有几种方法可以被用来降低组织和细胞¹⁸的胆固醇水平。一种方法是接触溶解在脂蛋白缺乏血清中的他汀类药物，以抑制HMG-CoA还原酶，控制胆固醇合成率^{19，20。19,}然而，这些降胆固醇药物也抑制沿美价酮途径形成非固醇产物。因此，加入少量的美价，使这些产品的形成^21，并增强这种方法的特异性。降低胆固醇水平的另一种方法是使用β-环糊精。这些糖原蛋白单体单体具有一个内部疏水性腔，其直径与固醇²²的大小相匹配，便于从细胞中提取胆固醇，从而消耗其原生胆固醇含量^23。例如，2-羟丙基-β-环糊精（HP_CD），这是一种临床前药物，目前正在测试治疗尼曼-皮克C型疾病，一种遗传性致命的代谢紊乱，其特征是淋索质胆固醇储存^24。胆固醇消耗水平取决于所使用的特定衍生物。例如，HP_CD 提取的胆固醇的容量低于甲基化衍生物，甲基β-环糊精（M+CD）24，25，26，27，28，29，30。^{29,3024,25,26,27,28,}值得注意的是，然而，β-环糊精还可以提取其他疏水分子，除了胆固醇，这可能会导致非特异性的影响^31。与耗竭相比，细胞和组织可以通过与胆固醇²³的中饱和的β-环糊精进行治疗，专门与胆固醇一起丰富。这种方法也可用作胆固醇消耗³¹中使用的β-环糊精特异性的对照。组织和细胞中胆固醇的消耗非常简单，可以通过将细胞暴露30-60分钟到溶解在用于储存细胞的介质中的5 mM M_CD来实现。这种方法可导致胆固醇含量降低50%（例如，在海马神经元^32，大鼠脑动脉^33）。另一方面，准备β-环糊精-胆固醇复合物用于组织和细胞的胆固醇富集更为复杂，将在协议部分进行说明。

使用饱和胆固醇的β-环糊精来丰富组织和细胞的替代方法涉及使用LDL，它依赖于组织/细胞¹⁸中表达的LDL受体。虽然这种方法提供了使用细胞的天然胆固醇平衡机制的优点，但它有几个局限性。首先，不能用这种方法来丰富不表达LDL受体的组织和细胞。其次，低密度脂蛋白颗粒除了胆固醇外，还含有其他脂质。具体来说，LDL由蛋白质ApoB_100（25%）组成和以下脂质（75%）：~6-8%胆固醇，+45-50%胆汁酯，+18-24%磷脂，和+4-8%三甘油^34。因此，通过低密度脂蛋白颗粒输送胆固醇是非特异性的。第三，表达低密度脂蛋白受体的组织和细胞中低密度脂蛋白增加的百分比可能明显低于使用饱和胆固醇的环糊精观察到的含量。例如，在以前的研究中，通过低密度脂蛋白使啮齿动物脑动脉与胆固醇的丰富率仅使胆固醇水平增加^10-15%35。相反，如协议部分所述，这些动脉与胆固醇饱和的动脉的浓缩导致胆固醇含量增加>50%（参见代表结果部分，图1）。

异种卵母细胞中胆固醇水平的变化
异种卵母细胞是一种异质表达系统，通常用于研究细胞和蛋白质功能。早期的研究表明，Xenopus卵母细胞的胆固醇与磷脂摩尔比为0.5± 0.1^36。由于这种内在的高胆固醇水平，增加胆固醇含量在这个系统中是具有挑战性的，但可以通过膜磷脂和胆固醇制成的分散实现。为此，我们选择的磷脂与用于形成人造平面脂质双层的磷脂相似，包括L-β-磷脂乙醇胺（POPE）和1-棕榈-2-奥莱基-sn-糖二烯-3-磷脂-l-塞林（POPS），如协议部分所述。这种方法可能导致胆固醇含量增加 >50%（参见代表结果部分，图 2）。

用基于磷脂的分散物丰富Xenopus卵母细胞的替代方法是使用胆固醇饱和的环糊精，这与组织和细胞的丰富方式类似。然而，我们发现这种方法的可重复性和效率较低，胆固醇含量平均增加约25%。这可能是由于这两种方法的加载能力不同（请参阅代表结果部分，图 3）。相反，已经表明，使用环糊精来消耗Xenopus卵母细胞的胆固醇，可以导致胆固醇含量^{降低40%36。}

在这里，我们专注于哺乳动物组织和细胞的胆固醇丰富，通过应用环糊精饱和胆固醇，和异种卵母细胞使用脂质体。这两种方法都可以加以利用，以划定胆固醇水平增加对蛋白质功能的影响。蛋白质功能胆固醇调制的机制可能涉及直接相互作用⁸和/或间接效应^9。当胆固醇通过直接相互作用影响蛋白质功能时，胆固醇水平增加对蛋白质活动的影响可能与细胞类型、表达系统或浓缩方法无关。例如，我们利用这两种方法来确定胆固醇对G蛋白的影响，内向纠正钾（GIRK）通道，以心房肌细胞^37、海马神经元32、38、HEK293³⁹细胞和异种卵母细胞^{32,3832、37,37}表示。这些研究的结果是一致的：在所有三种类型的哺乳动物细胞和两栖卵母细胞胆固醇上升调节GIRK通道功能（参见代表结果部分，图4，海马神经元和相应的实验在Xenopus卵母细胞）。此外，这些研究中的观察结果也符合在心房肌细胞^37，4040和海马神经元^32，38,38新鲜从动物接受高胆固醇饮食⁴⁰的研究的结果一致。³⁷值得注意的是，使用M+CD的海马神经元的胆固醇富集逆转了用于治疗高胆固醇饮食对胆固醇水平和GIRK功能³⁸影响的阿托伐他汀疗法的效果。在其他研究中，我们研究了突变对胆固醇敏感性的影响，使用Xenopus卵母细胞和HEK293细胞⁴¹来纠正体内的钾通道Kir2.1。同样，突变对通道灵敏度的影响在两个系统中是相似的。

两种浓缩方法在确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响方面应用不计其数。特别是，使用环糊精-胆固醇复合物来丰富细胞和组织是非常普遍的，主要是因为它的特异性。最近的例子包括确定胆固醇对HERG通道激活和底层机制^{的影响42，}发现胆固醇激活G蛋白耦合受体平滑促进刺猪信号^43，以及通过膜相关链接蛋白⁴⁴确定胆固醇在干细胞生物力学中的作用和辅助生成。在我们自己的工作中，我们利用哺乳动物组织富集与M_CD：胆固醇复合物，研究胆固醇富集对基本功能的影响，以及大电导（BK，MaxiK）在血管平滑肌35、45、46中钙和电压门通道（BK，MaxiK）的药理学特征。^35,45,46在其他研究中，我们使用基于磷脂的分散方法来丰富具有胆固醇的Xenopus卵母细胞，以确定不同区域在Kir2.1和GIRK通道中胆固醇敏感性41、47、48、49^47,48,49中的作用，并确定这些通道^{4132、50、51}中的假定胆固醇结合位^,点。^32,50