Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Les ARN et les protéines liant l’ARN contrôlent divers processus cellulaires, y compris l’épissage, la traduction, la biogenèse ribosome, la régulation épigénétique et la transition du destin^{cellulaire 1,2,3,4,5,6}. Les mécanismes délicats de ces processus dépendent de l’arrangement spatial et temporel unique des ARN et des PRR. Par conséquent, une étape importante vers la compréhension de la régulation de l’ARN au niveau moléculaire consiste à révéler les informations positionnelles sur les sites contraignants des P RB.

Une stratégie appelée liaison croisée et immunoprécipitation (CLIP-seq) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN avec les liaisons UV suivies de l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt⁷. La principale caractéristique de la méthodologie est l’induction de liens croisés covalents entre une protéine liant l’ARN et ses molécules d’ARN directement liées (dans ~1 Å) par irradiation UV⁸. Les empreintes RBP peuvent être déterminées par le clustering des balises CLIP et l’appel de pointe, qui ont généralement une résolution de 30−60 nt. Alternativement, l’étape de transcription inverse de CLIP peut conduire à des indélébiles (insertions ou suppressions) ou des substitutions aux sites de liaison croisée, ce qui permet d’identifier les sites de liaison protéique sur les ARN à une résolution à nucléotide unique. Des pipelines comme Novoalign et CIMS ont été développés pour l’analyse des résultats de séquençage à haut débit de CLIP-seq⁸. Plusieurs méthodes clip-seq modifiées ont également été proposées, y compris la résolution individu-nucléotide reliant et immunoprécipitant (iCLIP), clip amélioré (eCLIP), irCLIP, et ribonucleoside-amélioré photoactivatable cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Malgré l’utilisation à grande échelle des méthodes traditionnelles clip-seq dans l’étude des P RB, les méthodes CLIP présentent plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’électrophoresis de gel dénaturé fastidieux et la procédure de transfert de membrane peuvent mener à la perte de l’information, et causer la complexité limitée de séquence. Deuxièmement, la méthode clip à base d’anticorps protéiques peut tirer vers le bas un complexe protéique au lieu d’une seule protéine cible, ce qui peut conduire à de fausses interactions positives protéine-ARN à partir des RBPs copurifiés. Troisièmement, la stratégie à base d’anticorps nécessite une grande quantité d’anticorps de haute qualité, ce qui rend l’application de ces méthodes inadéquate pour l’étude des RBPs sans anticorps de haute qualité disponibles. Quatrièmement, la méthode CLIP traditionnelle exige que l’ATP radioétique étiqueter les ARN liés aux protéines.

La forte affinité de la streptavidine avec les protéines biotinylées en fait une approche très puissante pour purifier des protéines ou des complexes protéiques spécifiques. La biotinylation efficace des protéines portant une séquence artificielle de peptide par ligase bactérien de biotine de BirA exprimée ectopiquement dans les cellules mammifères en fait une stratégie efficace pour exécuter la purification de biotine in vivo^13. Nous avons développé une méthode clip-seq modifiée ^{appelée FBIo}CLIP-seq(FLAG-Bioteinté Cross-lencrage et jemmunoprecipitation suivie d’un séquençage à haut débit) en utilisant FLAG-biotin tag tandem purification¹⁴ (Figure 1). Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque tous les P RB en interaction sontéliminés ( figure 2). Les conditions de lavage rigoureuses permettent également de contourner le SDS-PAGE et le transfert de membrane, qui est exigeant en main-d’œuvre et techniquement difficile. Et semblable à eCLIP et irCLIP, la ^{méthode FBIo}CLIP-seq est sans isotopes. Sauter les étapes de fonctionnement et de transfert du gel permet d’éviter la perte d’informations, de garder intactes les interactions protéine-ARN authentiques et d’augmenter la complexité de la bibliothèque. De plus, l’efficacité élevée du système de marquage en fait un bon choix pour les P RB sans anticorps de haute qualité disponibles.

Ici, nous fournissons une description étape par étape du protocole CLIP-seq ^fbiopour les cellules mammifères. En bref, les cellules sont reliées entre elles par 254 nm UV, suivies de la lyse cellulaire et de l’immunoprécipitation FLAG (FLAG-IP). Ensuite, les complexes protéine-ARN sont encore purifiés par la capture d’affinité de biotine et les ARN sont fragmentés par digestion partielle avec MNase. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylaté et ligaté avec un linker de 3′. Un lieneur d’ARN de 5′ est ajouté après que l’ARN soit phosphorylaté avec PNK et élulisé par la digestion de proteinase K. Après transcription inverse, les signaux arn lié aux protéines sont amplifiés par PCR et purifiés par purification du gel agarose. Deux RBPs ont été choisis pour illustrer le ^{résultat de FBIo}CLIP-seq. LIN28 est une protéine liant l’ARN bien caractérisée impliquée dans la maturation des microARN, la traduction des protéines et la reprogrammation^{cellulaire 15,16,17}. WDR43 est une protéine contenant du domaine WD40 qui coordonnerait la biogenèse ribosome, la transcription eucaryotique et le contrôle de la pluripotence des cellules souches^{embryonnaires 14,18}. Conformément aux résultats précédemment rapportés pour LIN28 avec CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq révèle des sites contraignants de LIN28 sur des motifs « GGAG » dans le microARN mir-let7g et les ARNM^16,19 (Figure 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq a également identifié la préférence contraignante de WDR43 avec des espaceurs transcrits externes de 5′ (5′-ETS) des pré-rRNAs²⁰ (Figure 4). Ces résultats valident la fiabilité de ^{la méthode FBIo}CLIP-seq.