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医学

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Published: February 22, 2020
doi:
10.3791/60714
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics,University of Alabama at Birmingham

Summary

Die Ausweichung von natürlichen Killer (NK) zellvermittelten Ausrottungen durch Krebszellen ist wichtig für die Krebsinitiierung und Progression. Hier stellen wir zwei nicht-radioaktivitätsbasierte Protokolle zur Bewertung der mit NK zellvermittelten Zytotoxizität gegenüber lebertumorzellen vor. Darüber hinaus wird ein drittes Protokoll zur Analyse der NK-Zellmigration vorgestellt.

Abstract

Natürliche Killerzellen (NK) sind eine Teilmenge der zytotoxischen Lymphozytenpopulation des angeborenen Immunsystems und nehmen als erste Verteidigungslinie teil, indem sie pathogeninfizierte, bösartige und gestresste Zellen löschen. Die Fähigkeit von NK-Zellen, Krebszellen auszurotten, macht sie zu einem wichtigen Werkzeug im Kampf gegen Krebs. Mehrere neue immunbasierte Therapien werden für die Krebsbehandlung untersucht, die entweder auf die Verbesserung der Aktivität der NK-Zellen oder auf die Erhöhung der Empfindlichkeit von Krebszellen für die NK-Zell-vermittelte Ausrottung angewiesen sind. Um diese therapeutischen Ansätze effektiv zu entwickeln, sind jedoch auch kostengünstige In-vitro-Assays zur Überwachung der von NK zellvermittelten Zytotoxizität und Migration erforderlich. Hier stellen wir zwei In-vitro-Protokolle vor, die die Wirkung der NK-Zell-Zytotoxizität auf Krebszellen (oder andere Zielzellen) zuverlässig und reproduzierbar überwachen können. Diese Protokolle sind nicht radioaktivbasiert, einfach einzurichten und können für ein Screening mit hohem Durchsatz skaliert werden. Wir präsentieren auch ein auf Flow Cytometrie basierendes Protokoll zur quantitativen Überwachung der NK-Zellmigration, das auch für ein Hochdurchsatz-Screening skaliert werden kann. Zusammen können diese drei Protokolle verwendet werden, um wichtige Aspekte der NK-Zellaktivität zu überwachen, die für die Fähigkeit der Zellen, dysfunktionale Zielzellen auszurotten, notwendig sind.

Introduction

Die Fähigkeit des menschlichen Körpers, nicht selbst zu identifizieren und Fremdkörper auszurotten, ist der Schlüssel zum menschlichen Überleben gegen Krankheitserreger und Bösartigen1. Die menschliche Immunantwort spielt die wichtigste Rolle in diesem Prozess2,3,4. Basierend auf den wichtigsten Eigenschaften und Funktionen kann das menschliche Immunsystem grob in zwei Hauptfunktionsgruppen eingeteilt werden: das adaptive Immunsystem und das angeborene Immunsystem. Das adaptive Immunsystem ist typischerweise spezifisch für einen bestimmten Erreger und hat ein immunologisches Gedächtnis und ist daher langanhaltend und ansprechbar für zukünftige Reinfektionen durch den gleichen Erreger5,6,7,8,9. Im Gegensatz dazu ist die angeborene Immunität in ihrer Zielausrottung viel umfassender und relativ unspezifisch. Daher dient die angeborene Immunantwort in der Regel als erste Linie der immunologischen Verteidigung10. Natürliche Killerzellen (NK) gehören zum angeborenen Immunsystem und machen 10 bis 15 % der gesamten zirkulierenden Lymphozyten11aus. NK-Zellen tilgen Zielzellen über zwei Hauptmechanismen. Erstens setzen NK-Zellen nach Bindung an Zielzellen, die aktivierende Liganden exdrücken, das membranstörende Protein Perforin und Serinproteasegranzyme durch Exozytose frei, die gemeinsam Apoptose in den Zielzellen12,13,14,15induzieren. Zusätzlich interagieren NK-Zellen, die FasL und Tumornekrose-Faktor-bezogene Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) exezieren, mit Zielzellen, die Todesrezeptoren exdrücken (Fas/CD95), was zu einer caspaseabhängigen Apoptose16führt. Am wichtigsten ist, NK-Zellen erfordern keine Prästimulation, wie Antigen-Präsentation, um Pathogen-infizierte oder bösartige Zellen auszurotten; daher befinden sie sich in der Regel in einem killbereiten Zustand17,18. Um die Tumorentwicklung und -progression zu hemmen und Krebszellen auszurotten, müssen NK-Zellen zur Tumorstelle migrieren und einmal in der Tumormikroumgebung die Zielzellen identifizieren und angreifen.

In der Vergangenheit wurden NK-Zell-Effektor-Funktionen hauptsächlich durch Degranulation und Zytotoxizität s.a.19,20,21überwacht. NK-Zellzytotoxizität kann auch mit 51Chrom-Freisetzung assay22,23,24,25gemessen werden. Dieser Test hat jedoch einige spezifische Anforderungen, einschließlich der Notwendigkeit eines Gammazählers, und ist radioaktivitätsbasiert, was eine Schulung im Umgang mit und Entsorgung radioaktiver Materialien erfordert und ein Gewisses Risiko für den Benutzer darstellt. Daher wurden mehrere neue nicht-radioaktivitätsbasierte Assays entwickelt und eingesetzt, um die Aktivität von NK-Zellen zu untersuchen.

Hier beschreiben wir zwei solcher Protokolle, die kolorimetrische Milchdehydrogenase (LDH) messbasierte NK-Zell-vermittelte Zytotoxizitäts-Assay und Calceinacetoxymethyl (AM) Färbungsbasierte mikroskopische Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Krebszellausrottung. Diese Assays erfordern nicht die Verwendung von Radioisotopen, sind einfach, empfindlich und identifizieren reproduzierbar Faktoren, die die NK-Zellfunktion modulieren. Da die NK-Zellfunktion nicht vollständig ausgewertet werden kann, ohne Änderungen bei der NK-Zellmigration zu überwachen, stellen wir außerdem eine auf Flow-Zytometrie basierende quantitative Methode zur Überwachung der NK-Zellmigration dar.

Protocol

1. Vorbereitung von Kulturmedium für NK-Zellen und Lebertumorzellen Verwenden Sie menschliche natürliche Killerzellen (z. B. NK92MI) und menschliche Leberkrebszelllinie (z. B. SK-HEP-1). Prepare NK cell culture medium for NK92MI human NK cells by adding the following components to 500 mL of minimum essential medium Eagle alpha without ribonucleosides and deoxyribonucleosides to the indicated final concentrations: 0.02 mM folic acid (100 μL of 100 mM folic acid), 0.2 mM myoinositol (500 μL of 200 mM myoinositol), 0.1 mM β-mercaptoethanol (3.5 μL of 14.3 M β-mercaptoethanol), 2 mM L-glutamine (5 mL of 200 mM L-glutamine), 1% penicillin/streptomycin (5 mL of 100x penicillin/streptomycin), 12.5% fetal bovine Serum (FBS) und 12,5% Pferdeserum. Mit einer sterilen Filtrationseinheit mit 0,22 m mischen und filtern und bei 4 °C lagern. Bereiten Sie Kulturmedium für lebertumorzelllinie SK-HEP-1 vor, indem Sie 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin zu dem modifizierten Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit hohem Glukose-Patienten (DMEM) mit 2 mM L-Glutamin hinzufügen. 2. Farbmetrischer LDH-Messbasierter NK-Zell-vermittelter Zytotoxizitätstest SK-HEP-1-Zellen in einer 100-mm-Zellkultur-Petrischale in 5%CO2 bei 37 °C in einemCO2-Inkubator auf 70 bis 80 % Konfluenz anbauen. Erzeugen Sie eine einzellige Suspension durch erste Waschzellen mit 5 ml 1x Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) gefolgt von inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in 5%CO2 bei 37 °C in einem CO2-Inkubator, bis eine Einzelzellsuspension erzeugt wird.HINWEIS: Die Aktivität von NK-Zellen kann durch gestresste Krebszellen durch Veränderungen in der Expression von NK-Zell-aktivierendem Liganden in Krebszellen induziert werden. Daher sollten gesunde und subkonfluente Krebszellen für genaue Ergebnisse verwendet werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass NK-Zellrezeptoren und Liganden empfindlich auf Trypsinisierung26,27sein können. Daher sollte das Trypsinisierungsprotokoll sorgfältig optimiert und übermäßige Trypsinisierung vermieden werden. Nach der Trypsinisierung 10 ml SK-HEP-1-Kulturmedium und Zentrifuge bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen konischen Zentrifugenrohr hinzufügen. Waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren In 5 ml Kulturmedium. Parallel dazu zentrieren Sie die NK92MI-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr. Waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren Sie in 5 ml NK92MI Zellkulturmedium.HINWEIS: NK92MI-Zellen werden im NK-Zellkulturmedium angebaut und ähnlich wie in Schritt 2.1 beschrieben erhalten. Zählen Sie die Zellen SK-HEP-1 und NK92MI mit einem Hämozytometer oder einem verfügbaren automatisierten Zellzähler. Fügen Sie SK-HEP-1-Zellen (Zielzellen) (1 x 104/100 L/Well) und NK92MI-Zellen (Effektorzellen) (1 x 105/100 l/well) im Verhältnis von 1:10 Ziel:Effektor und Saatgut in dreifachen Bohrungen in einer 96-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die 96-Wellplatte bei 37 °C in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5%CO2 für 3 h. Nach der Inkubation Zentrifugeplatte bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Ohne das Zellpellet zu stören, sammeln Sie 100 L Überstand aus jedem Brunnen und übertragen Sie in einen Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte. Fügen Sie 50 l LDH-Substrat hinzu, mischen Sie sie gut, und brüten Sie die Platte 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l Stop-Lösung (50% Dimethylformamid und 20% Natriumdodecylsulfat bei pH 4.7) hinzufügen. Messen Sie sofort die Absorption der Platte bei 490 nm und 680 nm mit einem Plattenleser. Subtrahieren Sie die Absorption bei 680 nm von der Absorption bei 490 nm. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) NK-Zellzytotoxizität mit der folgenden Formel.wobei LDH-Experimente (Effektor + Zielzellen) die Absorption von NK92MI-Zellen und SK-HEP-1-Zellen ist, LDH-Effektorzellen allein die Absorption von NK92MI-Zellen, LDH spontan die Absorption von SK-HEP-1-Zellen allein und LDH maximal die Absorption von SK-HEP-1 Zellen mit Lysepuffer.ANMERKUNG: Um Serumstörungen zu reduzieren, verwenden Sie immer die folgenden Steuerelemente: Zielzellen allein (SK-HEP-1), Effektorzellen allein (NK92MI), Zielzellen mit Lysepuffer als vollständige Lysesteuerung, Zielzellmedium, NK92MI-Medium sowie Zielzellmedium und NK92MI Medium im Verhältnis 1:1. 3. Calcein AM Staining-basierte mikroskopische Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität Kultur SK-HEP-1-Zellen bis zu 70 bis 80% Koninfluenza. Generieren Sie eine einzellige Suspension durch erste Waschzellen mit 5 ml 1x PBS gefolgt von inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA. Zentrifuge SK-HEP-1-Zellen in einem 1 ml sterilen Zentrifugenrohr bei 160 x g für 3 min. Das Pellet in 3 ml serumfreiem DMEM aussetzen. Fügen Sie den SK-HEP-1-Zellen 1,5 l Calcein-AM-Lösung (10 mM) hinzu und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur. Zentrifugenkalkein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr. Waschen Sie Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS, um überschüssigen Calcein AM Farbstoff zu entfernen. Parallel dazu Zentrifugieren NK92MI-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr. Waschen Sie das Zellpellet einmal mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren Sie in 5 ml NK92MI Zellmedium. Zählen Sie Calcein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen und NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. SK-HEP-1-Zellen im Kulturmedium bei 1 x 105 Zellen/ml und NK92MI-Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml im NK-Zellmedium aussetzen. Plattenkalkam-beschrifteten SK-HEP-1-Zellen (Zielzellen) (1 x 104/100 l/well) mit NK92MI-Zellen (Effektorzellen) (1 x 105/100 l/well) (1:10 Ziel:Effektor-Verhältnis) pro Brunnen in dreifachen Brunnen in einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die 96-Wellplatte bei 37 °C in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5%CO2 für 4 h. Erfassen Sie nach der Inkubation Fluoreszenzbilder der calcein AM-markierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Erfassen Sie mindestens 10 verschiedene Felder jeder Replikation für jede Behandlungsbedingung. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Bilder für jede Replikation und Zählung von calcein AM-positiven markierten Zielzellen aus, die mit oder ohne NK92MI-Zellen inkubiert werden. Berechnen Sie % Zytotoxizität mit der folgenden Formel.HINWEIS: Verwenden Sie als Steuerelemente Zielzellen ohne NK92MI-Zellen und vollständig lysierte Zielzellen als vollständige Lysesteuerung. Für eine vollständige Lyse inkubieren Sie die Zellen in 0,5% Triton X-100 für 1 h (20 l von 5% Triton X-100 in 200 l Kulturmedien). 4. NK Zellmigration Assay Nk92MI-Zellen und Zentrifugenzellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr wachsen. Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 5 ml 1x PBS und setzen Sie die Zellen in 3 ml serumfreiem NK92MI-Zellmedium wieder auf. Zählen Sie NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Platte NK92MI-Zellen (2,5 x 105 Zellen/100 l/Well) im oberen Fach der transwell durchlässigen Kammer (6,5 mm Durchmesser Einsatz und 5 m Porengröße). In der unteren Kammer 0,6 ml serumfreies Medium hinzufügen, das Material enthält, das auf NK-Zell-Chemoattractant-Eigenschaften (z.B. konditioniertes Medium, Chemokine, Zytokine) getestet werden soll.HINWEIS: Verwenden Sie bei der Herstellung von konditioniertem Medium ein reduziertes Serummedium ohne zusatzserum, um Interferenzen von Serumproteinen im Migrationstest zu beseitigen. Inkubieren Sie die 24 gut durchlässigen Kammern bei 37 °C für 4 h. Nach 4 h die nicht haftenden und migrierten NK92MI-Zellen aus der unteren Kammer sammeln und zur weiteren Analyse in fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen (FACS) übertragen.HINWEIS: Die Kulturzeit kann je nach Art der Zielzellen sowie der Menge und Kinetik der von den Zielzellen erzeugten Chemokine variieren. Daher sollte diese Zeit empirisch für jeden Zelltyp, Chemokin und Experiment bestimmt werden. Fügen Sie jedem Rohr, das migrierte NK-Zellen enthält, eine vorgegebene Anzahl von Zählperlen für die Durchflusszytometrie in einem Volumen von 50 l hinzu. Bewerten Sie das Volumen von 300 L/Well-Zellsuspensionen mit jedem Durchflusszytometer, das in der Lage ist, eine automatisierte FACS-basierte Zellzählung zu verwenden.HINWEIS: Mischen oder Wirbel mischen Sie die Zählperlen für die Durchflusszytometrie jedes Mal vor dem Gebrauch gründlich, um sicherzustellen, dass eine konstante Anzahl von Perlen verwendet wird, um die experimentelle Variabilität zu minimieren. Reverse Pipetting wird mit Zählperlen empfohlen, um die Genauigkeit zu erhalten. Verwenden Sie nur NK-Zellen und Zählperlen für die Durchflusszytometrie als FACS-Analysesteuerelemente. Die Autoren empfehlen, mindestens 10.000 Perlen + NK-Zellen zusammen zu lesen, eine Menge, die gut funktioniert hat. Diese Zahl kann jedoch je nach Denkbedingungen variieren. Daher sollte die kombinierte Anzahl von Perlen + NK-Zellen für jede Art von Experiment empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, Experimente mit biologischen Triplicaten durchzuführen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen und die Variabilität zwischen den verschiedenen Zellanzahlen zu berücksichtigen. Berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK92MI-Zellen mit dieser Formel:wobei A = Anzahl der Zellen, B = Anzahl der Perlen, C = zugewiesene Perlenzahl des Loses (Anzahl der Zählperlen für die Durchflusszytometrie/50 l; in diesem Beispiel 49.500) und D = Volumen der Probe (L).ANMERKUNG: Wenn für die FACS-Analyse 300 l Probenvolumen (migrierte Zellen) mit 50 l Zählperlen für die Durchflusszytometrie verwendet wird, ist die absolute Anzahl der migrierten Zellen = 1.700 Zellen /3.300 Perlenereignisse x 49.500 Perlen/300 l = 84,975 Zellen/L. Die Berechnung sollte korrigiert werden, wenn die Probe verdünnt wird oder wenn ein anderes Volumen an FACS-Zählperlen verwendet wird.

Representative Results

NK-Zellzytotoxizitäts-Assays und NK-Zellmigrationstest wurden mit der SK-HEP-1-Lebertumorzelllinie als Modellsystem durchgeführt. Um die NK-Zellzytotoxizität mit dem LDH-Assay zu messen, wurden SK-HEP-1-Zellen, die entweder eine unspezifische (NS) shRNA oder shRNA-Targeting-Transkriptionsfaktor 4 (ATF4) exzättierten, mit NK92MI-Zellen in einer 96-Well-Platte für 3 h inkubiert (Abbildung 1A). ATF4 hat sich bisher gezeigt, nk Zellzytotoxizität durch Upregulating der aktivierenden Liganden ULBP128zu regulieren. Die LDH-Aktivität im Zusammenhang mit der tötung von NK-Zellen wurde kolorimetrisch gemessen, und die prozentuale Zytotoxizität wurde mit der in Protokoll 1 beschriebenen Formel berechnet. ATF4-Knockdown reduzierte die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität signifikant im Vergleich zu NK-Zellen, die NS shRNA exdrücken (Abbildung 1B-D). Wir haben auch die ZYtotoxizität der NK-Zelle mit einem Calcein AM-Färbe-basierten Assay gemessen. Zu diesem Zweck wurden SK-HEP-1-Zellen, die NS shRNA oder ATF4-targeting shRNAs exdrücken, mit Calcein AM beschriftet und mit NK92MI-Zellen in 96 Wellplatten für 4 h inkubiert, wie in Abbildung 2Adargestellt. Nach der Inkubation wurden Bilder von Calcein-AM-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem FITC/GFP-Filter erfasst. Zellen, die von NK-Zellen abgetötet werden, werden durch diesen Ansatz nicht erkannt, da sie den Calcein-AM-Farbstoff nicht mehr behalten. Wie in Abbildung 2B,Cdargestellt, wird die Anzahl der Calcein-AM-positiven SK-HEP-1-Zellen nach Co-Kultur mit NK92MI-Zellen im Vergleich zu SK-HEP-1-Zellen, die ohne NK92MI-Zellen angebaut wurden, verringert. Wie erwartet reduzierte jedoch der ATF4-Knockdown über shRNA die zellvermittelte TÖTUNG von SK-HEP-1-Zellen, beobachtet durch eine größere Anzahl von Calcein AM-positiven Zellen (Abbildung 2B,C). Daher zeigten sowohl LDH-basierte als auch Calcein-AM-Assays konsistente Ergebnisse und bestätigten, dass ATF4-Knockdown die NK-vermittelte Krebszellzytotoxizität reduziert. Beide dieser Assays reichen aus, um die mit NK zellvermittelte Zytotoxizität zu bewerten; Es wird jedoch empfohlen, beide Methoden zu verwenden, um sowohl die Stringenz als auch das Vertrauen in die Ergebnisse zu erhöhen. Wir präsentieren auch die Ergebnisse eines 24 Well NK Zellmigration Assay. NK92MI-Zellen wurden in serumfreiem NK92MI-Medium in der oberen Kammer resuspendiert, und Chemokin, CC-Motiv, Ligand 2 (CCL2) wurde der unteren durchlässigen Kammer hinzugefügt. Die NK-Zellmigration wurde wie in Abschnitt 3 beschrieben (Abbildung 3A) beschrieben. Die Anzahl der migrierten NK92MI-Zellen wurde quantifiziert, indem Zählperlen für die Durchflusszytometrie hinzugefügt und anschließend die FACS-Analyse durchgeführt wurde. Wie in Abbildung 3B-Cdargestellt, war die Anzahl der NK92MI-Zellen, die in Richtung CCL2-haltiges Medium migriert waren, im Vergleich zum Kontrollmedium signifikant gestiegen. Abbildung 1: Farbmetrischer LDH-aktivitätsbasierter NK-Zell-vermittelter Zytotoxizitätstest. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte des kolorimetrischen LDH-Aktivitäts-basierten NK-Zellzytotoxizitäts-Assays darstellt. (B,C) Die ATF4-Expression wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder unspezifische (NS) shRNA oder shRNAs exemittieren, die ATF4 durch quantitative RT-PCR und Western Blotting ins Visier nehmen. (B) Der relative ATF4-mRNA-Gehalt wird nach normalisierter AUF ACTINB-Ebene in SK-HEP-1-Zellen gezeigt, die NS shRNA oder ATF4 shRNAs exemitzen. (C) ATF4- und ACTINB-Proteinspiegel in SK-HEP-1-Zellen, die NS shRNA oder ATF4 shRNAs exdrücken. (D) DIE zellvermittelte Zytotoxizität wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder NS shRNA oder ATF4 shRNAs nach der LDH-Methode exeklierten. Prozent (%) Gezeigt wird eine mit NK-Zell vermittelte Zytotoxizität. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt: SEM; ns, nicht signifikant; **p < 0.01, ***p < 0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Calcein AM-Färbebasiertemikroskope Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte der kalzein-AM-Färbemethode zur Messung der kN-zellvermittelten Zytotoxizität darstellt. (B) DIE mit der Zellvermittelte Zytotoxizität von NK wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder NS shRNA oder ATF4 shRNAs nach der Calcein-AM-Methode exeklierten. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Skalenbalken = 200 m. (C) Prozent der Calcein AM-positiven Zellen für das Experiment, das in Panel B vorgestellt wurde. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: FACS-basierter quantitativer NK-Zellmigrationstest. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte des FACS-basierten NK-Zellmigrationstestes darstellt. (B,C) NK Zellmigration Assay wurde durchgeführt, nachdem 50 ng CCL2 in die untere Kammer der 24 Well-Platte hinzugefügt. (B) Repräsentative NK-Zellmigrationspunktdiagramme für Steuerelement- oder CCL2-behandelte Kulturmedien werden angezeigt. (C) DIE NK-Zellmigrationsdaten (Mittelwert SEM) werden für das experimentierte Inteil B. ***p < 0.001 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die hier beschriebenen Zytotoxizitäts- und Migrationsmethoden können verwendet werden, um die NK-Zellzytotoxizität gegenüber Krebszellen und NK-zellvermittelten Immun-Evasion-Mechanismen bei bösartigen Tumoren zu bewerten sowie therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die die Aktivität/Funktion von NK-Zellen verbessern. Die Protokolle sind einfache, empfindliche, reproduzierbare und bevorzugte Alternativen zum klassischen Radioaktivitätsbasierten 51-Chrom-Freisetzungstest. Die Protokolle wurden speziell für den Einsatz in den meisten Laboratorien entwickelt, mit einfachen farbmetrischen, mikroskopischen oder FACS-basierten Auslesungen, die leicht zu interpretieren sind, sodass die Forscher zuverlässige Schlussfolgerungen ziehen können. Alle sind skalierbar für Screening-basierte Ansätze mit hohem Durchsatz. Obwohl die Protokolle im Kontext einer einzigen leberförmigen Tumorzelllinie vorgestellt werden, können sie leicht an andere Krebszelltypen und/oder andere nicht-krebskranke Zielzellen angepasst werden.

Während alle vorgestellten Methoden robust und reproduzierbar sind, können interexperimentelle Variationen mit verschiedenen Chargen von Krebszellen und NK-Zellen auftreten. Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse die Schlussfolgerungen der Experimente genau unterstützen, ist es ratsam, das Experiment mindestens zweimal mit biologischen Triplicaten zu wiederholen.

Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Wachstumsrate von NK92MI-Zellen langsam sein kann. Daher sollte für Experimente mit 50 oder mehr Proben im Voraus genügend NK92MI angebaut werden, um Verzögerungen zu vermeiden. Außerdem müssen alle in den Protokollen beschriebenen Kontrollen implementiert werden, um falsche und nicht reproduzierbare Ergebnisse zu vermeiden. Eine weitere Einschränkung des NK-Zytotoxizitäts-Assays ist, dass das Verhältnis von NK zu Krebszellen sowie die Inkubationszeit für jede Zielzelle optimiert werden muss. Zum Beispiel haben wir verschiedene Verhältnisse von Krebszellen zu NK-Zellen (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 und 1:80) für die Leberkrebszelllinien sowie mehrere Inkubationszeiten (2, 3, 4, 5 und 6 h) getestet. Basierend auf unseren Ergebnissen beobachteten wir die konsistentesten Ergebnisse mit 1:10 und 1:20 Verhältnissen von Krebszellen zu NK-Zellen und Inkubation für 3 h.

Darüber hinaus werden Krebszellen, die aus soliden Tumoren gewonnen werden, auf der Oberfläche der Kulturplatte anhaften und wachsen, während NK-Zellen in Suspension wachsen. Wenn die Inkubationszeit länger als 3 h ist, ist es ratsam, ultraniedrige Befestigung 96 Wellplatten zu verwenden, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten und biologischen Replikationen verbessern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass NK-Zell-induzierte Zytotoxizitäts-Assays auch mit primären NK-Zellen durchgeführt werden können, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) isoliert sind. Allerdings gibt es bei solchen Experimenten einige Einschränkungen. Erstens können diese Experimente nicht so einfach skaliert werden wie bei NK92MI-Zellen. Zweitens kann eine Batch-zu-Charge-Variation der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen, die aus PMBCs isoliert sind, hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und Interpretation der Ergebnisse problematisch sein. In ähnlicher Weise werden andere menschliche NK-Zelllinien in der Literatur beschrieben und könnten in diesen Arten von Experimenten verwendet werden, einschließlich NKL-Zellen29; Im Gegensatz zu NK-92MI-Zellen sind NKL-Zellen jedoch IL-2-abhängig und nicht kommerziell verfügbar.

Bei der Betrachtung der beschriebenen Calcein-AM-Experimente ist es wichtig zu beachten, dass Calcein AM nach dem Zelltod30in apoptotischen Körpern verbleibt. Daher sollte die Quantifizierung der Calcein-AM-Färbung sorgfältig durchgeführt werden, da sie zu einer Unterschätzung der NK-Zytotoxizität führen kann.

Ähnlich wie bei NK zellvermittelte Zytotoxizität spielt die Modulation der NK-Zellmigration durch Zytokine und andere Chemopviele eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NK-Zellfunktion. Der hier beschriebene NK-Zellmigrationstest bietet eine einfache Plattform, um die NK-Zellmigration im Kontext eines Stimulus wie Chemokin oder Chemoattractant zu bewerten. Dieser Test kann verwendet werden, um Agenten zu bewerten, die die NK-Zellmigration entweder fördern oder stören können – also Dieenhancer und Repressoren der NK-Zellmigration identifizieren. Diese Methode kann auch nützlich sein, um die regulatorische NK-Zellmigration als Folge einer genetischen/epigenetischen Veränderungen (Upregulation oder Downregulation) oder durch medikamentöse Behandlung zu untersuchen.

Um die NK-Zellmigration genau zu messen, sollten nur wenige wichtige Schritte ausgeführt werden. Für alle Experimente mit konditioniertem Medium ist es wichtig, dass gleichwertige konditionierte Mittel sowohl unter Kontroll- als auch unter Behandlungsbedingungen verwendet werden, um genaue Messungen zu erhalten. Die Zeit der Inkubation wird mit gereinigten Chemoattractants und konditioniertem Medium variiert. Schließlich sind Transwell-Migrationstests gut etabliert und gelten als ausgezeichnete Methode zur Bewertung der NK-Zellmigration; Jedoch fehlt den homogenen Monokulturen, die in den Assays verwendet werden, die komplexe Physiologie von Geweben oder sogar 3D-Kulturen, die die Tumormikroumgebung genauer imitieren könnten.

Obwohl es einige Einschränkungen für die in diesem Artikel vorgestellten NK-Zellzytotoxizitätstests und NK-Migrationstests gibt, sind diese Assays auf eine breite Palette von immunologischen Studien anwendbar und bieten somit wichtige und zuverlässige Methoden zur Bewertung von NK-Zellen. und NK-Zellmodulatorische Immuntherapeutika.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken uns für Zuschüsse der National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) und 1R01 CA218008-01A1 (NW). Wir erkennen auch die Finanzierung von W81XWH1910480 und W81XWH-18-1-0069 an NW an.

Materials

Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056
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References

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Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).
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