Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Fare kaynaklı organoidlerin kullanımı mevzuat standartlarına uygun ve Walter ve Eliza Hall Enstitüsü (WEHI) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Tüm insan organoid örnekleri Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl) aracılığıyla biyobankalardan alındı. UMC Utrecht Tıbbi Etik Komitesi (METC UMCU) tarafından, Hollanda İnsan Denekleri Yasası’na uygunluğu sağlamak amacıyla HUB’ın talebi üzerine yetki ler alınmış ve uygun olduğunda bağışçılardan bilgilendirilmiş onay almıştır. 1. Reaktiflerin hazırlanması %4 (w/v) paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, 400 mL fosfat tamponlu salini (PBS) su banyosunda 60 °C’nin hemen altına ısıtın. PFA tozu 20 g ekleyin ve bir karıştırıcı kullanarak eritin. Sonra, 10 M NaOH birkaç damla ekleyin. Buz üzerinde soğumaya bırakın ve pH’ı 7,4’e ayarlamak için 10 M HCl’lik birkaç damla ekleyin. PBS ile 500 mL ve aliquot (2 aya kadar -20 °C’de saklayın).NOT: PfA’nın bozulmasını önlemek için 60 °C’nin üzerinde ısıtmayın. Hazırlama süresi = 4 saat. PBS’yi Tween-20 (PBT) (%0,1 v/v) ile hazırlamak için 1 mL Ara-20 ila 1 L PBS ekleyin (4 °C’de 4 haftaya kadar saklayın).NOT: Hazırlama süresi = 10 dk. 100 mL 0,5 M ethylenediamminetetraasetik asit (EDTA) hazırlamak için, 18,6 g EDTA ve 2,5 g NaOH ila80mL dH 2 O ekleyin.2 1 M Tris’in 500 mL’sini hazırlamak için 60,55 g Tris’i 42 mL konsantre (−38) ile çözün 300 mL dH2O’ndaki HCl, pH’ı 8’e ayarlayın ve 500 mL doldurun. Organoid yıkama tamponu (OWB) hazırlamak için 1 mL Triton X-100, 2 mL (w/v) SDS ve 2 g büyükbaş serum albumin (BSA) ila 1 L PBS (4 °C’de 2 haftaya kadar saklayın).NOT: Hazırlama süresi = 10 dk. 220 mL FUnGI yapmak için 110 mL gliserol ile 20 mL dH2O, 2,2 mL Tris tampon (1 M, pH 8,0) ve 440 μL EDTA (0,5 M) ile karıştırın. Fruktoz 50 g ekleyin ve çözünmüş kadar karanlıkta oda sıcaklığında (RT) karıştırın. Temizlendiğinde, 49 g fruktoz ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Daha sonra 33,1 g üre ekleyin ve eriyene kadar karıştırın (karanlıkta 4 °C’de saklayın).NOT: Yüksek sıcaklıklarda fruktoz karamelize olarak ısıtmayın. FUnGI (v/v) gliserol, %9.4 (v/v) dH2O, 10.6 mM tris baz, 1.1 mM EDTA, 2.5 M fruktoz ve 2.5 M üreden oluşur. Hazırlama süresi = 1 gün. PBS-BSA (%1 w/v) hazırlamak için 1 g BSA’yı 100 mL PBS’de çözün (4 °C’de 2 haftaya kadar saklayın).NOT: Hazırlama süresi = 10 dk. 2. Organoid iyileşme NOT: Aşağıdaki adımlar, 100−500 μm boyutunda 24 kuyu plakası ile yetiştirilen bodrum membran ekstresinde (BME) yetiştirilen organoidler için geçerlidir. Kültür ortamını aspire edin ve 1x buz gibi PBS ile yıkayın. 3B matrisi bozmaktan kaçının. Plakayı buza koyun ve her kuyuya 1 mL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Yatay bir çalkalayıcı (40 rpm) üzerinde 4 °C’de 30−60 dk kuluçka.NOT: 3B matris damlacıkları tamamen çözülmelidir. %1 PBS-BSA daldırma ve 2x yukarı ve aşağı boru lama ile BSA ile 1 mL pipet ucu kat. Bu kaplama organoidlerin uca yapışmasını önleyecektir. 15 mL konik bir tüpün iç tarafını kaplamak için %1 PBS-BSA’nın 5 mL’si ile doldurun, 2−3x ters çevirin ve PBS-BSA’yı atın.NOT: Bu kaplama fiksasyona kadar tüm plastik sarf malzemeleri için gereklidir (adım 3.3). Kaplamalı bir uç kullanarak kuyunun içeriğini 5−10x’i nazikçe askıya alın ve organoidleri kaplanmış 15 mL’lik tüplere aktarın. Aynı kimliğe sahip farklı kuyulardan gelen organoidler aynı tüpte biraraya getirilebilir. Durulama ve tüm organoidler toplamak için iyi her kültüriçin buz gibi% 1 PBS-BSA 1 mL ekleyin. 10 mL’ye soğuk PBS ekleyin ve 3B matrisin görünür bir katmanı olmadan sıkı bir pelet elde etmek için 70 x g ve 4 °C’de 3 dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Dikkatle supernatant çıkarın. 3. Fiksasyon ve engelleme 1 mL buz gibi PFA’da, kaplamalı 1 mL uçlu organoidleri dikkatlice yeniden askıya alın. 4 °C’de 45 dk. Tüm organoidler arasında bile fiksasyon sağlamak için kaplamalı 1 mL ucu kullanarak fiksasyon süresiboyunca organoidleri yavaşça yeniden askıya alın. Tüpe 10 mL buz gibi PBT ekleyin, tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın, 10 dk kuluçkaya yatın ve her ikisi de 4 °C’de 70 x g’deaşağı doğru döndürün.NOT: Bu adımdan itibaren uçların kaplanması genellikle gerekli değildir, çünkü çoğu organoid tip fiksasyon dan sonra uca yapışmaz. Ancak, bazı organoidler fiksasyon sonra bile kaplamalı plastik gerektirebilir. Buz gibi OWB (kuyu başına en az 200 μL OWB) pelet yeniden askıya alarak organoidler blok ve 24 iyi süspansiyon plaka organoidler aktarın.NOT: Büyük bir peletten organoidler farklı boyamalar yapmak için birden fazla kuyuya bölünebilir. En az 15 dakika 4 °C’de kuluçka. 4. İmmün etiketleme Pipet 200 μL OWB boş bir kuyuda iyi bir referans olarak hizmet vermektedir.NOT: İmmün etiketleme, antikor kullanımını azaltmak için 48 veya 96 kuyulu plakalarda da yapılabilir. Ancak, kullanıcı hem boyama ve yıkama performansı daha küçük hacim nedeniyle azaltılabilir farkında olmalıdır. Organoidlerin tabağın dibine yerleşmesine izin verin.NOT: Bu bir stereomikroskop kullanılarak kontrol edilebilir ve koyu bir arka plan kullanılarak daha kolay yapılır. Plakayı 45° yatırın ve 200 μL OWB’de organoidleri bırakarak OWB’yi çıkarın (200 μL’yi tahmin etmek için referansı iyi kullanın). Şekil 1’dekisonuçlar için primer antikorlar 2kat konsantre (örneğin, E-kadherin [1:400] ve Ki67 [1:200] ile 200 μL OWB ekleyin; keratin 5 [1:500], keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], ve Ki67 [1:200] Şekil 2sonuçları için ) ve gece boyunca tüp 4 °C’de hafif sallayarak /sallayarak (yatay çalkalayıcıda 40 rpm). Ertesi gün, OWB 1 mL ekleyin. Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OwB’yi plakada 200 μL bırakarak çıkarın. OWB 1 mL ekleyin ve hafif sallanan / sallayarak 2 saat yıkayın. Adımı 4.6’yı iki kez daha tekrarlayın. Organoidler 3 dakika için plakanın altına yerleşmek için izin verin. OWB’yi kuyuda 200 μL bırakarak çıkarın. İkincilantikorlar, konjuge antikorlar ve boyalar 2kat konsantre (örneğin, DAPI [1:1000], sıçan-AF488 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 1’deki sonuçlar için 200 μL OWB ekleyin; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], tavşan-AF555 [1:500], fare-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 2sonuçları için ; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] Şekil 3sonuçları için ) ve gece boyunca 4 °C’de inkübe ederken hafif sallayarak/sallayarak. Ertesi gün, 4.5−4.7 adımlarını tekrarlayın. Organoidleri 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın ve 3 dk boyunca 70 x g’de aşağı doğru döndürün. 5. Organoidlerin optik temizlenmesi Organoidleri bozmadan boru lar atarak OWB’yi mümkün olduğunca çıkarın. FUnGI (en az 50 μL, RT) ucu kesilmiş 200 μL ucu kullanarak ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça askıya alın. 20 dakika RT’de kuluçka.NOT: FUnGI ile optik takas küçük doku küçülme neden olabilir. Bu, tek katmanlı ve çok katmanlı organoidlerin genel morfolojisini etkilemez; ancak, büyük lümenile küresel şekilli monokatmanlı organoidler çökebilir. Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler 4 °C ‘de (en az 1 hafta) veya -20 °C’de (en az 6 ay) saklanabilir. 6. Konfokal görüntüleme için slayt hazırlığı Silikon dolgu maddesi ile 10 mL’lik bir şırınga hazırlayın(Malzeme Tablosu). 200 μL’lik bir uç takın ve şırıngaya bastıktan sonra viskoz silikonun yumuşak bir şekilde akmasını sağlamak için ucunu kesin. Bir slayt ortasında 1 cm x 2 cm bir dikdörtgen çizmek için şırınga kullanın. 200 μL’lik bir ucun ucunu kesin ve FUnGI’deki organoidleri dikdörtgenin ortasına aktarın. Üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Kapana kısılmış hava kabarcıklarını en aza indirmek için önce kapağın sol tarafını yerleştirin, sonra kapana kısılmış hava kalmayana kadar coverslip’i yavaşça soldan sağa indirin ve coverslip’i bırakın.NOT: Organoidler için boyut olarak simililer spacers zarar görmelerini önlemek için kullanılabilir. Silikon dolgu sıvısına sıkıca takmak için kapağın tüm kenarlarına hafifçe basınç uygulayın. Slayt görüntüleme için hazır.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numune 4 °C (en az 1 hafta) veya -20 °C (en az 6 ay) olarak saklanabilir. 7. Görüntü edinme ve işleme Konfokal lazer tarama mikroskobu(Malzeme Tablosu)kullanarak, kaydırağı konfokal görüntüleme için çok daldırma 25x veya yağ daldırma 40x hedefi ile görüntüleyin. 25x hedefi için aşağıdaki kazanım ayarlarını kullanın: tarama modu çerçevesi, kare boyutu 1024 x 1024, voxel boyutu 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, piksel çalışma süresi <2 μs, çift yönlü tarama, ortalama sayı 1, bit derinliği 8. Fotobeyaztmayı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın (<genel olarak %5, zayıf boyama için ). Alt ve üst sınırları tanımlamak ve Z-adım boyutunu en iyi şekilde ayarlamak için Z-stack modunu kullanın. Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını belirtin.NOT: Bu ayarlarla, <300 μm çapında tipik bir organoidin veri boyutu <1 GB'dır. Karo taraması veri setleri için, mikroskop(Tablo Malzemeler)ile birlikte yazılımgörüntüleme dosyaları dikiş. İşlem bölümünde, yöntem olarak Dikiş’i seçin, parametreler altında Yeni Çıktı’yı seçin ve dikişi için dosyayı seçin. Dikiş elemek için Uygula tuşuna basın. Görüntüleme yazılımında(Malzeme Tablosu) 3B Görünüm sekmesi altında görüntülemenin 3B görüntülenmiş bir temsilini edinin ve daha sonra parlaklık, zıtlık ve 3B işleme özelliklerini optimize edin. Sonuçların RGB anlık görüntülerini TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.