Hela 3D-struktur och cellulära innehållet av organoider, liksom deras fenotypiska likhet med den ursprungliga vävnaden kan fångas med hjälp av encells upplösning 3D-bildframställning protokollet beskrivs här. Detta protokoll kan tillämpas på ett brett spektrum av organoider varierande ursprung, storlek och form.
Organoid teknik, in vitro 3D-kulturing av miniatyr vävnad, har öppnat ett nytt experimentellt fönster för cellulära processer som styr organutveckling och funktion samt sjukdom. Fluorescensmikroskopi har spelat en stor roll i att karakterisera deras cellulära sammansättning i detalj och visar deras likhet med den vävnad de härstammar från. I den här artikeln presenterar vi ett omfattande protokoll för högupplösta 3D-bildbehandling av hela organoider på immunofluorescerande märkning. Denna metod är allmänt tillämplig för bildbehandling av organoider som skiljer sig i ursprung, storlek och form. Hittills har vi tillämpat metoden på luftvägar, kolon, njure och leverorganoider som härrör från frisk mänsklig vävnad, samt mänskliga brösttumörorganoider och musbröstkörtelorganoider. Vi använder ett optiskt clearingmedel, FUnGI, som möjliggör förvärv av hela 3D-organoider med möjlighet till encellig kvantifiering av markörer. Detta tre dagars protokoll från organoid skörd till bildanalys är optimerad för 3D-avbildning med hjälp av konfokalmikroskopi.
Utvecklingen av nya kulturmetoder, såsom organoid teknik, har möjliggjort kultur av organ i en maträtt1. Organoider växer till tredimensionella (3D) strukturer som ressemble deras vävnad av ursprung som de bevara fenotypiska och funktionella egenskaper. Organoider är nu avgörande för att ta itu med grundläggandebiologiska frågor 2, modellering sjukdomar inklusive cancer3, och utveckla personliga behandlingsstrategier4,5,6,7. Sedan det första protokollet för att generera organoider som härrör från intestinala vuxna stamceller8, organoid teknik har utvidgats till att omfatta ett brett spektrum av friska och cancervävnader som härrör från organ inklusiveprostata 9, hjärnan10, lever11,12, mage13, bröst14,15, endometrium16, spottkörtel17, smaklök18, bukspottkörteln19, ochnjure 20.
Utvecklingen av organoider har instämt med ökningen av nya volumetriska mikroskopi tekniker som kan visualisera arkitekturen av hela montera vävnad i 3D21,22,23,24. 3D-avbildning är överlägsen traditionella 2D vävnad avsnitt imaging i visualisera den komplexa organisationen av biologiska exemplar. 3D-information visar sig vara avgörande för att förstå cellulär sammansättning, cellform, cell-öde beslut och cell-cell interaktioner av intakta biologiska prover. Icke-förstörande optisk snittning tekniker, såsom confocal eller multi-foton laser scanning mikroskopi (CLSM och MLSM) och ljus blad fluorescens mikroskopi (LSFM), nu möjliggöra en kombinerad visualisering av både fina detaljer, liksom allmän vävnad arkitektur, inom en enda biologisk exemplar. Denna kraftfulla bildframställning tillvägagångssätt ger möjlighet att studera den strukturella komplexiteten som kan modelleras med organoider25 och kartlägga den rumsliga fördelningen, fenotypiska identitet och cellulära tillstånd för alla enskilda celler komponera dessa 3D-strukturer.
Nyligen publicerade vi ett detaljerat protokoll för högupplöst 3D-avbildning av fasta och rensade organoider26. Detta protokoll är särskilt utformad och optimerad för bearbetning av känsliga organoid strukturer, i motsats till metoder för stora intakta vävnader såsom DISCO27,28, CUBIC29,30,31, och CLARITY32,33. Som sådan är denna metod i allmänhet tillämplig på en mängd olika organoider som skiljer sig i ursprung, storlek och form och cellulärt innehåll. Vidare, jämfört med andra volymetriska bildprotokoll som ofta kräver avsevärd tid och ansträngning, är vårt protokoll kravlös och kan slutföras inom 3 dagar. Vi har tillämpat vår 3D-bildbehandling protokoll för att visualisera arkitektur och cellulär sammansättning av nyutvecklade organoid system som härrör från olika vävnader, inklusive human airways34,njure 20, lever11, och mänskliga bröstcancer organoider15. I kombination med flerfärgad fluorescerande härstamning spårning, denna metod har också använts för att avslöja biopotensen av basala celler i mus bröstorganoider14.
Här förfinar vi protokollet genom att införa det giftfria clearingagenten FUnGI35. FUnGI-röjning uppnås i ett enda inkubationssteg, är lättare att montera på grund av sin viskositet, och bevarar bättre fluorescens under lagring. Dessutom introducerar vi natrium dodecyl sulfat (SDS) till tvättbufferten för att förbättra nukleära färgningar samt en silikonbaserad monteringsmetod för enkel glidberedning före mikroskopi. Figur 1 ger den grafiska översikten av protokollet (Bild 1A) och exempel på 3D-avbildade organoider (Bild 1B−D). Kort sagt, organoider återvinns från sin 3D-matris, fasta och immunolabeled, optiskt rensas, avbildas med hjälp av konfokalmikroskopi och sedan 3D återges med visualisering programvara.
Här lägger vi fram ett detaljerat protokoll för 3D-avbildning av intakta organoider med encellig upplösning. För att framgångsrikt kunna utföra detta protokoll måste vissa kritiska steg tas. I det här avsnittet vi belysa dessa steg och tillhandahålla felsökning.
Det första kritiska steget är borttagandet av 3D-matrisen. De flesta organoider förökas in vitro med användning av matriser som efterliknar in vivo extracellulära miljön för att förstärka bildandet av väl polariserade 3D-strukturer. Fixerande och efterföljande färgning inom 3D-matrisen är möjlig, men kan vara ofördelaktigt för penetration av antikroppar eller kan generera hög bakgrundssignal (data visas inte). Effektiv borttagning av matriser kan påverkas av typ av matris, mängden och storleken på organoiderna och långvarig odling. Därför kan optimering krävas för olika odlingsförhållanden. För organoider som odlas i Matrigel eller BME räcker ett 30−60 min steg i iskall cellåtervinningslösning för att lösa upp matrisen utan att skada organoiderna. Dessutom kan avlägsnande av den stödjande 3D-matrisen resultera i förlust av inhemska strukturer och störningar av organoida kontakter med andra celltyper, till exempel när organoider är co-odlade med fibroblaster eller immunceller. Dessutom är optimal organoid fixering avgörande för att bevara 3D vävnad arkitektur, protein antigenicitet och minimera autofluorescens. Infästning i 45 min med 4% PFA vid 4 °C är normalt tillräcklig för märkning av ett brett spektrum av organoider och antigener. Men en längre fixering steg, upp till 4 h, är vanligtvis mer lämpligt för organoider uttrycker fluorescerande reporter proteiner, men kommer att kräva optimering för olika fluoroforer. Fixeringstider kortare än 20 min är otillräckliga för att korrekt märka F-aktin med hjälp av phalloidin-sonder. En annan vanlig fråga är förlusten av organoider under protokollet. Det är därför viktigt att (i) försiktigt belägga pipet tips och rör med 1% BSA-PBS enligt beskrivningen vid hantering av ofixerade organoider för att förhindra dem från att hålla sig till plast, ii) använda låg följsamhet eller suspension plattor för att avvärja provet från att fastna på plattan, och (iii) ge tillräckligt med tid för organoiderna att bosätta sig i botten av plattan innan försiktigt bort buffertar. Pipetting viskös FUnGI kan införa bubblor. Hantering av det rensade provet vid RT minskar viskositeten och förbättrar användarvänligheten och minimerar därmed förlusten av organoider. Medan de flesta organoider är lätta att hantera, cystic organoider med en förstorad lumen har en hög tendens att kollapsa när fastställande med 4% PFA eller när rensas med FUnGI. Denna effekt kan minskas, men inte helt förhindras, genom att använda en annan fixativ (t.ex. formalin eller PFA-glutaraldehyd). Detta kan dock potentiellt påverka autofluorescens, antikropp penetration och epitope tillgänglighet. När cystiska organoider verkar vikta efter clearing, rekommenderas det att hoppa över clearing steg och bild av multi-foton mikroskopi, som är mindre hämmas av ljusspridning. Slutligen, erhålla hela 3D-strukturen av organoider kan vara utmanande och kräver minimalt avstånd mellan coverslip och organoid. Dessutom, när organoider har utrymme att röra sig i sin montering agent, detta kan resultera i X- och Y-skift samtidigt som du registrerar data i Z-djup. Använda mindre silikon tätningsmedel under glidberedning kan lösa suboptimal montering mellan coverslip och mikroskop slide. För lite silikon kan dock leda till organoid komprimering och förlust av deras inneboende 3D-struktur. FUnGI förbättrar hanteringen för glidmontering och stabilitet hos organoider medan bildtagning, på grund av dess högre viskositet.
Medan detta protokoll kan användas för ett brett spektrum av applikationer för att studera i djup cellulära innehåll och 3D-arkitektur av intakt organoider, bör vissa begränsningar övervägas. Denna metod är ganska låg genomströmning och tidskrävande. Faktum är att användarna bör komma ihåg att bildframställning stora intakta organoider i 3D kräver både plattsättning och prov förvärv i Z, vilket leder till långvarig förvärv gånger. Snabbare avbildning skulle kunna uppnås genom användning av mikroskoptillgångar, inklusive resonant eller spinning disk scanner, eller genom ljusplåtmikroskop teknik26. En annan faktor är att markörer kan heterogent uttryckas mellan olika organoider från samma prov. Därför bör flera organoider förvärvas för att bättre fånga denna organoid heterogenitet i kultur. Slutligen, medan den kompletta våta lab förfarandet är okomplicerad, kräver postprocessing av data färdigheter i bildanalys programvara för 3D-visualisering och kvantifiering, samt statistik för gruvdrift all information som finns i datauppsättningen.
Under det senaste årtiondet har området för volymavbildning kraftigt avancerat, på grund av både utvecklingen av ett brett spektrum av optiska clearingmedel och förbättringar inom mikroskopi och beräkningsteknik27,30,31. Medan tidigare de flesta studier fokuserade på stor volym avbildning av organ eller tillhörande tumörer, mer nyligen metoder för mindre och mer ömtåliga vävnader, inklusive organoid strukturer, har utvecklats36,37,38. Vi publicerade nyligen en enkel och snabb metod för bildframställning hela-mount organoider av olika ursprung, storlek och form på encellsnivå för efterföljande 3D-rendering och bildanalys26, som vi presenterade här med några förbättringar (t.ex. FUnGI, silikon montering) och åtföljs av en video protokoll. Denna metod är överlägsen konventionella 2D avsnittsbaserad avbildning i dechiffrera komplexa cell morfologi och vävnad arkitektur (Figur 2) och lätt att genomföra i laboratorier med en confocal mikroskop. Med små anpassningar till protokollet kan proverna göras kompatibla med, super-upplösning confocal, multi-foton samt ljusblad imaging, vilket gör detta protokoll allmänt tillämpliga och ger användarna ett kraftfullt verktyg för att bättre förstå den flerdimensionella komplexitet som kan modelleras med organoider.
The authors have nothing to disclose.
Vi är mycket tacksamma för den tekniska supporten från Princess Máxima Center for Pediatric Oncology och till Hubrecht Institute och Zeiss för bildframställningsstöd och samarbeten. All bildbehandling utfördes på Princess Máxima imaging center. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Prinsessan Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD stöddes av ett Marie Curie Global Fellowship och ett VENI-anslag från Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). ACR stöddes av ett av Europeiska rådets (ERC) startbidrag.
1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
Imaris software | Bitplane | ||
Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
Workstation | Dell |