Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital
Summary
Este protocolo describe una técnica para visualizar el comportamiento de los macrófagos y la muerte en peces cebra embrionarios durante la infección por Mycobacterium marinum. Se incluyen medidas para la preparación de bacterias, infección de embriones y microscopía intravital. Esta técnica se puede aplicar a la observación del comportamiento celular y la muerte en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.
Abstract
Zebrafish es un excelente organismo modelo para estudiar el comportamiento innato de las células inmunitarias debido a su naturaleza transparente y la dependencia únicamente de su sistema inmunológico innato durante el desarrollo temprano. El modelo de infección de Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) ha estado bien establecido en el estudio de la respuesta inmune del huésped contra la infección micobacteriana. Se ha sugerido que diferentes tipos de muerte de células macróforas conducirán a los diversos resultados de la infección micobacteriana. Aquí describimos un protocolo que utiliza la microscopía intravital para observar la muerte celular de los macrófagos en embriones de pez cebra después de la infección por M. marinum. Las líneas transgénicas de pez cebra que etiquetan específicamente macrófagos y neutrófilos se infectan mediante microinyección intramuscular de M. marinum etiquetado fluorescentemente en el cerebro medio o en el tronco. Los embriones de pez cebra infectados se montan posteriormente en agarosa de baja fusión y se observan mediante microscopía confocal en dimensiones X-Y-Z-T. Debido a que las imágenes en vivo a largo plazo requieren el uso de baja potencia láser para evitar el fotoblanqueo y la fototoxicidad, se recomienda encarecidamente un transgénico que exprese fuertemente. Este protocolo facilita la visualización de los procesos dinámicos in vivo, incluyendo la migración de células inmunitarias, la interacción con patógenos del huésped y la muerte celular.
Introduction
Se ha demostrado que la infección micobacteriana causa la muerte de células inmunitarias del huésped1. Por ejemplo, una tensión atenuada desencadenará apoptosis en los macrófagos y contendrá la infección. Sin embargo, una cepa virulenta desencadenará la muerte de células líticas, causando diseminación bacteriana1,2. Teniendo en cuenta el impacto que estos diferentes tipos de muerte celular tienen en la respuesta antimicobacteriana del huésped, se necesita una observación detallada de la muerte de las células de macrófagos durante la infección micobacteriana in vivo.
Los métodos convencionales para medir la muerte celular son utilizar manchas de células muertas, como Annnexin V, TUNEL o acridina naranja/yoduro propidium manchado3,4,5. Sin embargo, estos métodos son incapaces de arrojar luz sobre el proceso dinámico de muerte celular in vivo. La observación de la muerte celular in vitro ya ha sido facilitada por imágenes en vivo6. Sin embargo, si los resultados imitan con precisión las condiciones fisiológicas sigue sin estar claro.
El pez cebra ha sido un excelente modelo para estudiar las respuestas anti-mycobacterium del huésped. Tiene un sistema inmunológico altamente conservado similar al de los seres humanos, un genoma fácilmente manipulado, y los embriones tempranos son transparentes, lo que permite imágenes en vivo7,8,9. Después de la infección con M. marinum, peces cebra adultos forman estructuras típicas de granuloma maduro, y peces cebra embrionarios forman granuloma temprano como estructuras9,10. El proceso dinámico de interacción inmune innata de células-bacterias ha sido explorado previamente en el pez cebra M. marinum infección modelo11,12. Sin embargo, debido al alto requisito de resolución espacio-temporal, los detalles que rodean la muerte de las células inmunitarias innatas permanecen en gran medida indefinidos.
Aquí describimos cómo visualizar el proceso de muerte celular lítica de macrófagos desencadenada por la infección micobacteriana in vivo. Este protocolo también se puede aplicar a la visualización del comportamiento celular in vivo durante el desarrollo y la inflamación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la visualización de la muerte de macrófagos durante la infección micobacteriana. Basado en factores como la integridad de la membrana celular, la muerte celular impulsada por la infección se puede dividir en apoptosis y muerte celular lítica24,25. La muerte celular lítica es más estresante para el organismo que la apoptosis, porque desencadena una fuerte respuesta inflamatoria 24,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Zilong Wen por compartir cepas de peces cebra, el Dr. Stefan Oehlers y el Dr. David Tobin por compartir los recursos relacionados con M. marinum, Yuepeng He por su asistencia en la preparación de figuras. Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), el Programa de Formación Juvenil Sobresaliente de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (2018YQ54) (B.Y.), el Programa de Vela de Shanghái (18YF1420400) (B.Y.), y el Fondo Abierto de Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
