Визуализация макрофаг Lytic Cell Смерти во время микобактериальной инфекции в эмбрионах зебрафиш а через интравитальную микроскопию
Summary
Этот протокол описывает метод визуализации поведения макрофагов и смерти у эмбриональных зебры во время инфекции Mycobacterium marinum. В стоимость включены меры по подготовке бактерий, инфицированию эмбрионов и интравитальной микроскопии. Этот метод может быть применен к наблюдению клеточного поведения и смерти в аналогичных сценариях, связанных с инфекцией или стерильным воспалением.
Abstract
Зебрафиш является отличной моделью организма для изучения врожденного поведения иммунных клеток из-за его прозрачной природы и полагаться исключительно на его врожденную иммунную систему во время раннего развития. Модель инфекции «Зебрафиш Микобактерия» (M. marinum)была хорошо зарекомендована при изучении иммунного ответа хозяина против микобактериальной инфекции. Было высказано предположение, что различные макрофage клеточных типов смерти приведет к различным исходам микобактериальной инфекции. Здесь мы описываем протокол с использованием интравитальной микроскопии для наблюдения макрофаговной клеточной смерти в эмбрионах зебры после инфекции М. Маринум. Трансгенные линии зебрафиш, которые специально маркируют макрофаги и нейтрофилы, заражаются внутримышечной микроинъекцией флуоресцентно помеченного M. marinum в среднем мозге или стволе. Зараженные эмбрионы зебры впоследствии устанавливаются на низкорасплавленную агарозу и наблюдаются с помощью конфокальной микроскопии в измерениях X-Y—T. Поскольку долгосрочная живая визуализация требует использования низкой мощности лазера, чтобы избежать фотоотбеления и фототоксичности, настоятельно рекомендуется сильно выражающее трансгенное вещество. Этот протокол облегчает визуализацию динамических процессов in vivo, включая миграцию иммунных клеток, взаимодействие патогенов-хозяев и гибель клеток.
Introduction
Микобактериальная инфекция была продемонстрирована, чтобы вызвать смерть иммунных клеток хозяина1. Например, ослабленный штамм вызовет апоптоз у макрофагов и содержит инфекцию. Тем не менее, вирулентный штамм вызовет литическую гибель клеток, вызывая бактериальное распространение1,2. Учитывая влияние этих различных типов клеточной смерти на принимающей анти-микобактериальной реакции, подробное наблюдение макрофаг клеток смерти во время микобактериальной инфекции in vivo необходимо.
Обычные методы измерения смерти клеток используют пятна мертвых клеток, такие как Annnexin V, TUNEL, или acridine оранжевый / пропидий йодид окрашивания3,4,5. Однако эти методы не в состоянии пролить свет на динамичный процесс гибели клеток in vivo. Наблюдение смерти клеток in vitro уже способствовало живой визуализации6. Однако, являются ли результаты точно имитировать физиологические условия остается неясным.
Зебрафиш были отличной моделью для изучения принимающих анти-микобактерии ответов. Он имеет высоко консервированную иммунную систему, похожую на иммунную систему человека, легко манипулировать геном, и ранние эмбрионы прозрачны, что позволяет жить изображения7,8,9. После заражения M. marinum, взрослые зебра образуют типичные зрелые структуры гранулы, а эмбриональные зебры образуют раннюю гранулему, как структуры9,10. Динамический процесс взаимодействия врожденных иммунных клеток-бактерий был изучен ранее в модели инфекции зебрафиш M. marinum 11,12. Однако, из-за высокой пространственно-временной потребности в разрешении, детали, связанные со смертью врожденных иммунных клеток остаются в значительной степени неопределенными.
Здесь мы описываем, как визуализировать процесс макрофаговлистической клеточной смерти клеток, вызванной микобактериальной инфекцией in vivo. Этот протокол также может быть применен к визуализации клеточного поведения in vivo во время развития и воспаления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает визуализацию макрофагов смерти во время микобактериальной инфекции. На основе таких факторов, как целостность клеточной мембраны, инфекция обусловлена клеточной смерти можно разделить на апоптоз и литическом смерти клеток24,25. Л…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Зилонга Вэня за обмен штаммами зебры, д-ра Стефана Охлерса и д-ра Дэвида Тобина за совместное использование ресурсов, связанных с М. Маринумом, Yuepeng He за помощь в подготовке фигур. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81801977) (B.Y.), Выдающейся программой подготовки молодежи Шанхайской муниципальной комиссии по здравоохранению (2018Y-54) (B.Y.), Шанхайской парусной программой (18YF1420400) (B.Y.), а также Открытым фондом Шанхайской ключевой лаборатории туберкулеза (2018KF02)…
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
