Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale
Summary
Ce protocole décrit une technique pour visualiser le comportement et la mort de macrophage dans le poisson zèbre embryonnaire pendant l’infection de marinum de Mycobacterium. Des étapes pour la préparation des bactéries, l’infection des embryons et la microscopie intravitale sont incluses. Cette technique peut être appliquée à l’observation du comportement cellulaire et de la mort dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.
Abstract
Zebrafish est un excellent organisme modèle pour étudier le comportement inné des cellules immunitaires en raison de sa nature transparente et la dépendance uniquement sur son système immunitaire inné au cours du développement précoce. Le modèle d’infection du poisson zèbre Mycobacterium marinum (M. marinum) a été bien établi dans l’étude de la réponse immunitaire de l’hôte contre l’infection mycobactérienne. Il a été suggéré que différents types de décès de cellules de macrophage mèneront aux résultats divers de l’infection mycobactérienne. Ici nous décrivons un protocole utilisant la microscopie intravitale pour observer la mort de cellules de macrophage dans les embryons de poisson zèbre suivant l’infection de M. marinum. Les lignées transgéniques de poisson zèbre qui étiquetent spécifiquement les macrophages et les neutrophiles sont infectées par microinjection intramusculaire de M. marinum étiqueté fluorescent dans le cerveau moyen ou le tronc. Les embryons de poissons zèbres infectés sont ensuite montés sur une faible fonte de l’agarose et observés par microscopie confocale dans les dimensions X-Y-Z-T. Parce que l’imagerie en direct à long terme nécessite l’utilisation d’une faible puissance laser pour éviter le blanchiment photo et la phototoxicité, un transgénique fortement exprimant est fortement recommandé. Ce protocole facilite la visualisation des processus dynamiques in vivo, y compris la migration des cellules immunitaires, l’interaction des agents pathogènes hôtes et la mort cellulaire.
Introduction
L’infection mycobactérienne a été démontrée pour causer la mort de cellules immunitaires d’hôte1. Par exemple, une souche atténuée déclenchera l’apoptose dans les macrophages et contiendra l’infection. Cependant, une souche virulente déclenchera la mort des cellules lytiques, provoquant la dissémination bactérienne1,2. Compte tenu de l’impact de ces différents types de mort cellulaire ont sur la réponse antimycobactérienne hôte, une observation détaillée de la mort des cellules macrophages pendant l’infection mycobactérienne in vivo est nécessaire.
Les méthodes conventionnelles pour mesurer la mort cellulaire sont d’utiliser des taches de cellules mortes, telles que Annnexin V, TUNEL, ou acridine orange / propidium iodide coloration3,4,5. Cependant, ces méthodes sont incapables de faire la lumière sur le processus dynamique de la mort cellulaire in vivo. L’observation de la mort cellulaire in vitro a déjà été facilitée par l’imagerie en direct6. Cependant, si les résultats imitent avec précision les conditions physiologiques reste peu clair.
Le poisson zèbre a été un excellent modèle pour étudier les réponses anti-mycobacterium hôte. Il a un système immunitaire très conservé semblable à celui des humains, un génome facilement manipulé, et les premiers embryons sont transparents, ce qui permet l’imagerie en direct7,8,9. Après l’infection par M. marinum, le poisson zèbre adulte forme des structures granulomes matures typiques, et le poisson zèbre embryonnaire forme un granulome précoce comme les structures9,10. Le processus dynamique de l’interaction immunisée innée de cellules-bactéries a été exploré précédemment dans le modèle d’infection de M. marinum de poissons-zèbres11,12. Cependant, en raison de l’exigence de résolution spatio-temporelle élevée, les détails entourant la mort des cellules immunitaires innées restent en grande partie indéfinis.
Ici nous décrivons comment visualiser le processus de la mort de cellules lytiques de macrophage déclenchée par l’infection mycobactérienne in vivo. Ce protocole peut également être appliqué à la visualisation du comportement cellulaire in vivo pendant le développement et l’inflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la visualisation de la mort de macrophage pendant l’infection mycobactérienne. Basé sur des facteurs tels que l’intégrité de la membrane cellulaire, la mort cellulaire induite par l’infection peut être divisée en apoptose et la mort des cellules lytiques24,25. La mort cellulaire lytique est plus stressante pour l’organisme que l’apoptose, car elle déclenche une forte réponse inflammatoire 24,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Zilong Wen d’avoir partagé des souches de poissons zèbres, le Dr Stefan Oehlers et le Dr David Tobin pour le partage des ressources liées à M. marinum, Yuepeng He pour son aide dans la préparation des chiffres. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), l’Outstanding Youth Training Program de la Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.), et Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
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