Den menneskelige blod – hjerne barriere selektivt forhindrer indtrængen af hydrofile molekyler og patogener ind i hjernen. Flere patologier, herunder meningitis og postoperativ delirium, er forbundet med en øget gennemtrængelighed af blod – hjerne barrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodel for at teste barrierengennemtrængelighed ved mikrobiel traversal.
Den menneskelige blod – hjerne barriere (BBB) er karakteriseret ved en meget lav gennemtrængelighed for biomolekyler for at beskytte og regulere stofskiftet i hjernen. Den BBB er hovedsageligt dannet ud af endotelceller indlejret i kollagen IV og fibronectin-rige kælder membraner. Flere patologier skyldes dysfunktion af BBB efterfulgt af mikrobielle traversal, forårsager sygdomme som meningitis. For at teste effekten af flere parametre, herunder forskellige lægemidler og anæstesi, om permeabilitet en BBB vi etableret en ny menneskelig celle kultur model efterligne BBB med menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller celler. Endotelcellerne dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheder indtil sammenløbet og kan derefter behandles med forskellige forbindelser af interesse. For at påvise en mikrobiel traversal, er det øverste kammer med den apiske overflade af endotelceller podet med bakterier. Efter en inkubationsperiode er prøver af det nederste kammer belagt på agarplader, og de opnåede kolonier tælles, hvorved antallet af kolonier korrelerer med BBB’s gennemtrængelighed. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i denne eksperimentelle set-up for at belyse grundlæggende cellulære mekanismer i endotelceller, der bidrager til BBB. Desuden, denne platform gør det muligt at udføre en skærm for forbindelser, der kan påvirke permeabilitet af endotelceller. Endelig kan bakteriel tværgående studeres og knyttes til forskellige patologier, såsom meningitis. Det kan være muligt at udvide modellen og analysere bakteriernes veje gennem BBB. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol over den beskrevne metode til at undersøge BBB’s gennemtrængelighed.
Den menneskelige BBB er en unik grænse for hjernevæv, der adskiller hjernen fra blodet. Det strengt regulerer passage af større og hydrofile molekyler, blokerer paracellulær diffusion, og fastholder hjernen homøostase. Det beskytter også hjernen mod plasmaudsving, toksiner, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del af centralnervesystemets (CNS) immunitet. Siden opdagelsen for et århundrede siden1, mange undersøgelser er blevet gennemført for at forstå strukturen og funktionen af BBB. De komplekse interaktioner mellem celler, proteiner og signaler fra hjerne og blod kræver yderligere undersøgelse og modeller.
Den menneskelige BBB består af tre celletyper: hjernemikrovaskulære endotelceller (BMECs), pericytter og astrocytter2,3. BMECs adskiller sig fra de fleste af de endotelceller i kroppen, idet de besidder et stort antal stramme vejkryds og klæber vejkryds4,lav pinocytotisk aktivitet2,5, og en kontinuerlig kælder membran6,7 til at blokere paracellulære diffusion. Små lipofile molekyler kan diffuse og passere BBB efter deres koncentration gradient; større og hydrofile molekyler kommer ind i eller efterlader kun hjernen gennem polariserede selektive transportsystemer8. Denne forordning resulterer i en høj transendotelelektrisk modstand (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 , der er omvendt korreleret med permeabilitet9,10. Selv om BMEC’er bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Der er et tæt samspil mellem BMECs og astrocytter13; astrocytendfødderne bygger et lag omkring fartøjerne og fremkalder dannelsen af stramme vejkryds13,14. De er involveret i BBB-modning med forskellige faktorer, herunder omdannelse af vækstfaktor-β (TGF-β)15,16. Desuden spiller pericytter en central rolle i reguleringen af angiogenese17 og forhindre apoptose af endotel i cellulære differentiering18 (figur 1). De er indlejret i kælderen membran og giver strukturel stabilitet af fartøjet væg19.
Figur 1: Den skematiske struktur af blod- og hjernebarrieren. Den unikke struktur af den menneskelige BBB er sammensat af tre forskellige celletyper. Mikrokarlumen er omgivet af endotelceller, som er beriget i snævre vejkryds, og er ikke fenestrated. De er indlejret i kælderen membran, ligesom pericytter. Disse celler er vigtige for den strukturelle stabilitet af beholdervæggen og spiller en rolle i udviklingen af BBB ved siden af astrocytterne. Deres endefødder bygge et tæt lag omkring fartøjet og støtte bygningen af stramme vejkryds. Alle komponenter i BBB er vigtige for fysiologiske funktionalitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Mange forskellige patologier er relateret til sammenbruddet af BBB (f.eks septisk encefalopati). De berørte patienter har øget proteinindholdet i cerebrospinalvæsken20, og hjernen parenkym i de berørte gnavere viser en øget optagelse af markant kolloid jernoxid og aminosyrer21,22. Disse resultater peger i retning af en øget permeabilitet af BBB , der opstår sammen med en øget pinocytose i BcMECs21 og endotelaktivering23. En anden associeret patologi relateret til en ændret BBB er meningitis, en medicinsk nødsituation og en kompleks betændelse ledsaget af cerebralødem, der kan føre til neuronal celledød. Det primære indsejlingssted for cirkulerende bakterier formodes at være mikrokarerne24; BBB forhindrer dog, at bakterier kommer i brug. BBB’s permeabilitet er ikke altid forbundet med en stigning i eksperimentel hæmatogen meningitis25, og mekanismerne kan være multifaktorielle. Tilfældighed af sepsis med postoperative delirium (POD)26 og foreningen med præoperative infektioner27,28 angiver behovet for en BBB model, der gør det muligt for direkte eksponering for bakterier for at få en bedre forståelse i bakteriel patogenese.
Der er mange huller i forståelsen og kvantificeringen af den mikrobielle traversal gennem BBB. Derfor har vi udviklet en model, der giver mulighed for en bekvem test af forskellige faktorer og betingelser med en direkte sammenhæng mellem bakteriel tværgående og påvirkninger på gennemtrængelighed en BBB. Tidligere arbejde fokuserede på paracellulær permeabilitet og omfattede TEER-måling og sporstofflux. Desuden blev makromolekyletransport analyseret af konjugerede molekyler eller antistoffer, hvorved der kun blev udviklet forskellige modeller, der kun anvender endotelceller eller kombinationer med astrocytter og pericytter. På grund af vanskelighederne med at opnå humant væv på regelmæssig basis, mange dyrebaserede modeller anvendes. Hjerneendotelceller af kvæg- og svineoprindelse danner stramme monolag med en høj TEER, der danner velformet apitisk-basal polaritet og er velegnede til undersøgelser af små molekyletransport gennem BBB. Proteinerne adskiller sig i rækkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, hvilket gør undersøgelse af terapeutiske antistoffer vanskelig. Af denne grund, murine eller menneskelige kultur modeller kan være at foretrække. Mus eller rotter som prøve kilder har den fordel, at blive opnået fra velkarakteriserede arter, men giver få celler til studieformål. Dette kan omgås ved brug af udødeliggjort mus hjerne endotel (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primære dyrkede celler fra humant væv er vanskelige at opnå og håndtere regelmæssigt. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller, der anvendes i forskning undersøger den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En offentliggjort cellelinje er human cerebral mikrovaskulære endotelcellelinje hCMEC/D3, som er velegnet til at studere narkotikaoptagelse og er let at håndtere. Cellerne bygger et monolag og udtrykker bBB34’skarakteristiske stramme krydsproteiner , mens ekspressionsniveauet for claudin-5 formodes at være lavere end i intakte mikrokar35 , og mange specifikke transportører er blevet påvist på udskriftsniveau36 samt i proteomiske undersøgelser34. En relativt lav TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 er stadig en udfordring37. En anden kilde til hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (HPSC’er)38 og menneskelige navlestrengsblod-afledte stamceller fra cirkulerende endotelafomiog hæmatopoietiske slægter39,40. Begge differentieringsprotokoller resulterer i stramme cellemonolag og høje TEER-værdier (f.eks. 1.450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodeller kræver ekstrem pleje til dyrkning, men giver mulighed for at undersøge virkningen af regulering af hormoner41 eller sygdomme med genetisk baggrund42 på BBB udvikling.
I denne undersøgelse etablerede vi en udødeliggjort transfunderet human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, at efterligne BBB og studere bakteriel traversal. Celler er seedet på et filter og dyrkes til 100% sammenløb i denne celle kultur model. Bakterier er vaccineret i den øverste del af cellekulturkammer. Vi bruger Escherichia coli (E. coli) i vores stikprøveundersøgelse på grund af den høje forekomst af E. coli meningitis44. Det er blevet påvist, at den laveste permeabilitet af cellemonolayer forekommer mellem dag 13 og dag 15 efter såning45. Derfor udføres behandlingen af THBMEC monolaget efter dette tidspunkt, og bakterier vaccineres bagefter i mediet på monolagets apical overflade. Efter en inkubationstid kvantificeres bakterier, der var i stand til at krydse barrieren, via platingsmedium med bakterierne på agarplader og optælling af kolonierne. Et øget antal kolonier korrelerer med højere bakteriel traversal gennem BBB. TEER er omkring 70 Ω·cm246. Det er dog ikke nødvendigt at måle TEER i den beskrevne metode. Selv om det er en veletableret værdi for BBB’s gennemtrængelighed, synes det ikke at have nogen indvirkning på bakteriens gennemkørsel gennem BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontrol af tæthed i vores model. Det er i tidligere arbejde blevet påvist, at cellerne er i stand til at reagere på proinflammatoriske cytokiner og udtrykke typiske stramme krydsproteiner47. Dette giver mulighed for sammensatte screening og validering af et større sæt transporter substrater og receptorer.
Begrænset indsigt i patogenesen af mikrobielle traversal grænser yderligere udvikling af behandlinger for POD eller meningitis. Dødeligheden og sygeligheden af disse sygdomme kræver bedre patientbehandling, kræver forskning i de underliggende mekanismer og har brug for en robust platform for sammensat screening. De multifaktorielle hændelser kan studeres med humane BMECs. Flere vellykkede rapporterede isolationsprocedurer for BMEC’er fra en række arter har vist tab af cellernes karakteristiske molekylære signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne procedure blev transfunderet i meget tidlige passager, hvor de udviste specifikke hjerneendotelcelleegenskaber og bevarede dem43. Dette er vigtigt, fordi ikke alle trin i de berørte veje er blevet opdaget hidtil, og denne model synes at efterligne konventionelle BMECs. Vores præsenterede model viser direkte indflydelse på BMECs og den mikrobielle traversal gennem BBB.
Håndteringen af THBMEC-celler er ligetil, og det nødvendige tekniske udstyr findes i de fleste life science laboratorier. Vores model giver mulighed for en øjeblikkelig start på efterforskningsprocedurer efter THBMECs har bygget en stram monolayer. Anvendelsesfeltet kan være omfattende på grund af de mulige kombinationer mellem nye test og konventionelle analyser såsom TEER-måling eller mærkning med sporstoffer54. Det er også muligt at tilføje astrocytter eller pericytter for at lave en co- eller triple-kultur model. Narkotikaens indflydelse på det mikrobielle traversal kunne også testes i vores model ved at behandle THBMECs med forbindelser, før det tilinossere det øverste kammer med bakterier. Faktisk er det muligt at købe skær med filtre til 96 brøndplader, der gør det muligt at automatisering af proceduren. Dette kan lette gennemførelsen af høj-throughput narkotika screening systemer til at fremskynde opdagelsen af lægemidler mod de nævnte sygdomme og for at reducere bivirkninger på BBB under udviklingen af lægemidler.
Et kritisk skridt i den præsenterede metode er inkubationstiden efter tilsætning af bakterierne til det øverste kammer. Det er vigtigt at bruge timer som tidslinjer i protokollen, fordi generationen tid af E. coli er kun 20 min55. Ellers kan brugen af forskellige tidspunkter føre til vildledende resultater. Der er også en mulig risiko for kontaminering mellem øvre og nedre kammer under bakterieeksponeringen, hvis pladerne ikke håndteres med forsigtighed. Eventuelle ændringer af de 12 brøndplade på dette punkt kunne forurene mediet i underkammeret.
E. coli er en velkendt, meget almindelig årsag til bakteriel meningitis. Yderligere undersøgelser bør teste forskellige bakterier, der også er forbundet med meningitis, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse synes at bruge forskellige mekanismer til at krydse BBB og skal forstås bedre til behandling af patienter. Hos ældre patienter, forekomsten for POD stiger26 samt antallet af forekommende comorbiditeter. Det er kendt, at der er interaktioner mellem forskellige sygdomme, især systemiske dem som diabetes. I vores model er det muligt at simulere disse betingelser eller behandle cellerne, før de tilføjer bakterierne.
Modellen er begrænset af den direkte kontakt mellem THBMECs og bakterier, og yderligere forskning er nødvendig for at undersøge potentielle kontaktmekanismer for at opdage de involverede veje og proteiner. Det er dog muligt at fjerne skær og høste cellerne til yderligere analyse. Modellens TEER er lavere i forhold til stamcellemodellerne38,39,40. Vi bekræftede dette ved hjælp af en bakteriekoncentration, der ikke krydsede BBB i ubehandlede celler efter 6 timer.
Sammenfattende repræsenterer denne metode en robust platform til at analysere krydsning af bakterier gennem BBB med potentiale til at udvide det til high-throughput drug screeninger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Dr. Maryam Hussain for tidligere arbejde på denne metode, gruppen af PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for at give THBMECs og Juliane Weber for kritisk at læse manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af RTK 2155 (ProMoAge).
Agar – Agar | Carl Roth | 6494.3 | BioScience-Grade |
Autoclave | Systec | VX-150 | |
Bacteria E.coli strain GM2163 | Fermentas Life Sciences, Lithuania | ||
Photometer | Eppendorf | 6131 | |
Cells THBMEC | Group of M. F. Stins | ||
Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
Centrifuge Universal 320 | Hettrichlab | 1401 | |
Collagen IV | SIGMA Aldrich | C6745 | from human cell culture |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10311 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate | MERCK | 1065800500 | |
DMEM/F-12 | GIBCO/ Thermo Sc. | 11330032 | HEPES |
Falcon tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO/ Thermo Sc. | 10270 | value FBS -Brazil |
Fibronectin | SIGMA Aldrich | F0556 | solution human fibroblasts |
Heracell 150 CO2 Incubator | Heraeus | 50116047 | |
Incubator shaker I 26 New Brunswick | Eppendorf | M1324-0000 | |
Inoculation loop | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 641000 | |
LB Broth Base | GIBCO/ Thermo Sc. | 12780029 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
Microbial incubator B 6200 | Heraeus | 51015192 | |
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II | BIOAIR | 12469 | |
Microscope inverse | Zeiss | TELAVAL 31 | |
Micro tubes 2 ml | Sarstedt | 72,695,400 | |
Micro tubes 1,5 ml | Sarstedt | 72,706,400 | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 464-800 | |
Potassium chloride | Roth | HN02.3 | |
Potassium-di-hydrogen phosphate | Roth | P018.2 | |
Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
ThinCerts + Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 665631 | 12 well, pore size 3.0 µm |
Trypsin – EDTA | GIBCO/ Thermo Sc. | 15400054 | |
Vacuumpump Laboport | KNF | N 86 KT.18 |