신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서
Summary
우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.
Abstract
혈관을 둘러싼 지방 조직의 과도 한 금액 (주위 지방 조직, 일컬어 PVAT) 심혈 관 질환의 높은 위험과 관련 된. 상이한 지방 조직에서 유래한 ADSC는 뚜렷한 특징을 나타내며, PVAT로부터의 특징은 잘 특성화되지 않았다. 최근 연구에서, 우리는 periaortic 아치 지방 조직에 있는 몇몇 ADSCs가 보고했습니다 (PAAT) 신경 문장 세포에서 내려 (NCC), ectoderm에서 유래하는 철새 세포의 일시적인 인구.
이 백서에서는 Wnt-1 Cre+/-PAAT로부터 적색 형광 단백질(RFP)으로 표지된 NCC를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. Rosa26RFP/+ 마우스 및 시험관내에서 그들의 지방분화 분화를 유도한다. 간략하게, 기질 혈관 분획(SVF)은 PAAT로부터 효소적으로 해리되고,RFP+ 신경 문장 유래 ADSCs(NCADSCs)는 형광 활성화 세포 선별(FACS)에 의해 단리된다. NCADSCs는 갈색과 흰색 지방 세포로 분화하고, 저온 보존 될 수 있으며 , ~ 3-5 구절에 대한 지경 잠재력을 유지합니다. 우리의 프로토콜은 시험관 내 PVAT 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 PVAT로부터 풍부한 ADSC를 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 NCADSCs는 PVAT 분화에 관여하는 분자 스위치를 연구하기 위한 귀중한 시스템을 제공할 수 있다.
Introduction
비만의 보급은 심장 혈관 질병 및 당뇨병을 포함하여 관련 만성 질병의 리스크를 증가시키는 세계전반 증가하고 있습니다1. PVAT는 혈관을 포위하고 혈관 기능에서 관련시킨 내분비 및 paracrine 요인의 중요한 근원입니다. 임상 연구에 따르면 높은 PVAT 함량은 심혈관 질환2,3의독립적인 위험 인자이며, 그 병리학적 기능은 성분 지방 유래 줄기 세포(ADSCs)의 표현형에 따라 달라집니다 4.
뮤린 3T3-L1, 3T3-F442A 및 OP9과 같은 ADSC 세포주들은 지질발생 또는 지방발생을 연구하는 데 유용한 세포 모델이지만5,지질발생에 대한 조절 기전은 세포주와 1차 세포 간에 차이가 있다. 지체 성 혈관 세포 분획(SVF)에서 ADSCs는 지방 조직에서 직접 분리되고 지방세포로 분화하도록 유도되어 생체 내 지방형성 및 지방발생에서 가장 가능성이 높은 회생을유도한다 6. 그러나, 연약함, 부력 및 ADSCs의 크기 및 면역 표현형의 변화는 그들의 직접적인 격리를 어렵게 만듭니다. 또한, 상이한 절연 절차는 또한 이들세포의표현형 및 지방생성 전위 능력에 유의하여, 따라서 ADSC 무결성을 유지하는 프로토콜의 필요성을 강조할 수 있다.
지방 조직은 전형적으로 형태학적으로 및 기능적으로 구별되는 백색 지방 조직(WAT) 또는 갈색 지방 조직(BAT)8로분류되며, 이는 뚜렷한 ADSCs9를수용한다. 반면 아식스는 회항나달 및 인멸피하로부터 분리된 ADSC는 이전 연구에서특징이 있었지만9,10,11,12,BAT13으로주로 구성되는 PVAT로부터의 ADSCs에 대해서는 덜 알려져 있다.
최근 연구에서, 우리는 주경 아치 지방 조직 (PAAT)에 있는 RESIDENT ADSCs의 일부가 신경 문장 세포 (NCC)에서 파생된다는 것을 것을을 발견했습니다, ectoderm14,15에서유래하는 철새 전구 세포의 일시적인 인구. Wnt1-Cre 형질전환 마우스는 신경 문장 세포 개발16,17을추적하는 데 사용되었다. 우리는 Wnt-1 Cre+/- Wnt-1 Cre+/-생성Rosa26RFP/+ 마우스와 Wnt1-Cre + 마우스를 교차; Rosa26RFP/+ 마우스는 NCC와 그 후손이 적색 형광 단백질(RFP)으로 표시되어 생체 내 및 시험관 내15에서쉽게 추적됩니다. 여기서, 우리는 마우스 PAAT로부터 신경 문장 유래 ADSCs(NC-유래 ADSCs, 또는 NCADSCs)를 분리하는 방법을 설명하고 NCADSCs를 백색 지방세포 또는 갈색 지방세포로 분화하도록 유도한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 Wnt-1 Cre+/-PVAT에서 추출된 NCADSCs의 격리, 배양 및 지방 흡입에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. RfP +ADSC를 생산하도록 설계된 Rosa26RFP/+ 형질전환 마우스. 이전 보고서에 따르면 NCADSCs 및 비 NCADSCs22에서일반적인 다능성 중간엽 줄기 세포(MSCs) 마커의 발현에 유의한 차이가 없음을 보여주고, NCADSCs는 시험관 내 지방세포로 분화할 수 있는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1312504), 중국 국립자연과학재단(81970378, 81670360, 81870293), 상하이시 과학기술위원회(17411971000, 1714090202) 기금 제공 .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
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