السابق فيفو هيبوكامبال الضغط الشعرية-Pareniole الشرايين التحضير للدراسة الوظيفية
Summary
تفاصيل المخطوطة الحالية كيفيه عزل هيبوكامبال الشرايين والشعيرات الدموية من دماغ الفار وكيفيه الضغط عليها للضغط علي التصوير العضلي ، والمناعي ، والكيمياء الحيوية ، والدراسات الجزيئية.
Abstract
من التغييرات السلوكية خفيه إلى الخرف في مرحله متاخره ، يتطور العجز المعرفي الوعائي عاده بعد الاسكيميه الدماغية. السكتة الدماغية وتوقف القلب هي امراض المثلية الجنسية بشكل ملحوظ ، وكلاهما يحفز نقص التروية الدماغية. ومع ذلك ، كان التقدم في فهم الاعاقه المعرفية الوعائية ، ومن ثم تطوير العلاجات الخاصة بالجنس ، محدود جزئيا من التحديات في التحقيق في دوران المخ من نماذج الفئران في الدراسات الوظيفية. هنا ، نقدم نهجا لفحص الإشارات الشعرية إلى الشريانية في السابق فيفو هيبوكامبال الشعيرات الشعرية-Pareniole (hicapa) الاعداد من الدماغ الماوس. نحن وصف كيفيه عزل ، تعليب ، والضغط علي دوران الاوعيه الدقيقة لقياس قطر شرايين استجابه لتحفيز الشعرية. نعرض الضوابط الوظيفية المناسبة التي يمكن استخدامها للتحقق من سلامه الاعداد HiCaPA وعرض النتائج النموذجية ، بما في ذلك اختبار البوتاسيوم كعامل اقتران الاوعيه الدموية وتاثير المثبط تميزت مؤخرا من Kir2 الداخل تصحيح البوتاسيوم قناه الاسره ، ML133. وعلاوة علي ذلك ، نقارن الاستجابات في الاستعدادات التي يتم الحصول عليها من الفئران الذكور والإناث. في حين ان هذه البيانات تعكس التحقيقات الوظيفية ، ويمكن أيضا ان تستخدم نهجنا في البيولوجيا الجزيئية ، والكيمياء المناعية ، ودراسات الفيزيولوجيا الكهربية.
Introduction
وكانت الدورة الدموية علي سطح الدماغ موضوع الكثير من الدراسة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى امكانيه الوصول التجريبية. ومع ذلك ، فان طوبولوجيا الاوعيه الدموية الدماغية تخلق مناطق متميزة. وعلي النقيض من شبكه قرض قويه غنيه في اناستاوسيس مع قدره كبيره لأعاده توجيه تدفق الدم ، والشرايين داخل الاوعيه الدموية (PAs) العرض التبعي محدوده ، كل واحد منهم النبض حجم منفصل من الانسجه العصبية1،2. وهذا يخلق تاثير عنق الزجاجة علي تدفق الدم الذي ، مع الميزات الفسيولوجية فريدة من نوعها3،4،5،6،7،8، يجعل الشرايين داخل الدماغ موقع حاسم لتدفق الدم الدماغي (cbf) المادة9،10. وعلي الرغم من التحديات التقنية المتاصله في عزل وتعليب نظام الأداء ، شهد العقد الأخير زيادة في الاهتمام بالدراسات الوظيفية السابقة لفيفو باستخدام السفن المضغوطة11و12و13و14و15و16و17. أحد أسباب هذا الاهتمام المتزايد هو الجهد البحثي الكبير الذي اجري علي اقتران الاوعيه العصبية (NVC), اليه الحفاظ علي فرط الدم الوظيفي الدماغ18.
إقليميا, CBF يمكن ان تزيد بسرعة بعد تنشيط العصبية المحلية19. أليات الخلوية وخصائص الإشارات التي تتحكم في NVC غير مفهومه تماما. ومع ذلك, حددنا دور غير متوقع سابقا لشعيرات الدماغ خلال nvc في الاستشعار عن النشاط العصبي وترجمته إلى اشاره الكهربائية الاستقطاب لتمدد الشرايين المنبع20,21,22. إمكانيات العمل23و24 وفتح القناات الكبيرة التي تعمل بالتوصيل Ca2 +-المنشطk + (BK) علي القدمين الفلكيتين25,26 زيادة تركيز أيون البوتاسيوم الخلالي [k +]o, الذي يؤدي إلى تنشيط المعدل الداخلي القويK + (كير) القناات في بطانة الاوعيه يتم تنشيط هذه القناة عن طريق الخارجيةK + ولكن أيضا عن طريق فرط الاستقطاب نفسه. الانتشار من خلال تقاطعات الفجوة ، التيار فرط الاستقطاب ثم يجدد في الخلايا البطانية الشعرية المجاورة تصل إلى الشرايين ، حيث انه يسبب الاسترخاء عضلي وزيادة cbf20،21. وقد أدت دراسة هذه اليه إلى تطوير الاستعداد لقياس القطر الشرايين اثناء التحفيز الشعري مع العوامل الفعالة للاوعيه ، بالضغط علي الشعيرات الشعرية. ويتكون التحضير CaPA من الجزء الشرياني الداخلي الذي تم تعليبه مع الاجتثاث الشعرية سليمه ، المصب. يتم ضغط نهايات الشعرية ضد قاع الزجاج الغرفة بواسطة ميكروماص ، والتي يسد وتستقر تشكيل الاوعيه الدموية بأكمله20،21.
قدمنا سابقا الابتكارات المفيدة من خلال التصوير الاستعدادات capa من اللحاء الماوس20,21 والشرايين من اللوزة الفئران13 والحصين16,17. كما يتلقى الاوعيه الدموية هيبوكامبال المزيد من الاهتمام نظرا لقابليها للظروف المرضية ، وهنا نقدم طريقه خطوه بخطوه لاعداد CaPA من الفرس الحصين (HiCaPA) التي لا يمكن استخدامها فقط في الدراسات NVC وظيفية ولكن أيضا في البيولوجيا الجزيئية ، والكيمياء المناعية ، والفيزيولوجيا الكهربية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاعداد المضغوط HiCaPA (هيبوكامبال الشعرية-pareniole) الموصوفة في المخطوطة الحالية هو امتداد لإجراءاتنا الراسخة لعزل ، والضغط ، ودراسة الشرايين العقديه29. وقد ذكرنا مؤخرا ان القناات كير 2.1 في الدماغ الخلايا الغشائية الشعرية الزيادات في [K +]o المرتبطة التنشيط العصبية ، وتو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا جولز موران علي التعليقات الثاقبة علي المخطوطة. وقد تم تمويل هذا البحث من خلال جوائز من المنظمة التي لا تبغي الربح التابعة لمؤسسه كاداسيل معا ، ومركز صحة المراه والبحوث ، وR01HL136636 NHLBI (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
