Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.
Abstract
Lipide sind strukturell vielfältige amphipathische Moleküle, die in Wasser unlöslich sind. Lipide sind wesentliche Beiträge zur Organisation und Funktion biologischer Membranen, Energiespeicherung und -produktion, zelluläre Signalisierung, vesikulärer Transport von Proteinen, Organellebiogenese und regulierter Zelltod. Da die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae ein einzelliges Eukaryoten ist, das für gründliche molekulare Analysen zugänglich ist, half seine Verwendung als Modellorganismus, Mechanismen aufzudecken, die den Fettstoffwechsel mit dem intrazellulären Transport mit komplexen biologischen Prozessen innerhalb eukaryotischer Zellen verbinden. Die Verfügbarkeit einer vielseitigen Analysemethode für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist entscheidend, um tiefe Einblicke in diese Mechanismen zu erhalten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung der Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiae vor. Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Arten (einschließlich verschiedener isobarer oder isomerischer Formen) innerhalb jeder der 10 Lipidklassen. Diese Methode ist empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,2 pmol/l. Die Methode wurde erfolgreich angewendet, um Lipidome ganzer Hefezellen und ihrer gereinigten Organellen zu bewerten. Der Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bei dieser Methode kann die Ionisationseffizienz bei einigen Lipidarten erhöhen und kann daher zur Verbesserung ihrer Identifizierung und Quantifizierung eingesetzt werden.
Introduction
Eine Reihe von Beweisen zeigt, dass Lipide, eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen, spielen wesentliche Rolle in vielen lebenswichtigen Prozessen innerhalb einer eukaryotischen Zelle. Diese Prozesse umfassen die Montage von Lipid-Doppelschichten, die die Plasmamembran und Membranen umgebenden Zellorganellen bilden, den Transport kleiner Moleküle über Zellmembranen, die Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung und intrazelluläre Signaltransduktion, die Erzeugung und Speicherung von Energie, den Import und Export von Proteinen, die auf verschiedene Organellen beschränkt sind, vesikulären Handel mit Proteinen innerhalb des Endomembransystems und der Proteinsekretion sowie verschiedene Arten des regulierten Zelltodes1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Die angehende Hefe S. cerevisiae, ein einzelliger eukaryotischer Organismus, wurde erfolgreich verwendet, um einige der Mechanismen zu entdecken, die den wesentlichen Rollen von Lipiden in diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen zugrundeliegen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae ist ein wertvoller Modellorganismus für die Aufdeckung dieser Mechanismen, weil er für umfassende biochemische, genetische, zellbiologische, chemische, biologische, systembiologische und mikrofluidische Dissektionsanalysen21,22,23,24,25zugänglich ist. Weitere Fortschritte beim Verständnis von Mechanismen, durch die der Fettstoffwechsel und der intrazelluläre Transport zu diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen beitragen, erfordern empfindliche Massenspektrometrietechnologien für die quantitative Charakterisierung des zellulären Lipidoms, das Verständnis der molekularen Lipidkomplexität und die Integration der quantitativen Lipidomik in eine multidisziplinäre Plattform der Systembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
Aktuelle Methoden für die Massenspektrometrie-unterstützte quantitative Lipidomik von Hefezellen und Zellen anderer eukaryotischer Organismen sind nicht ausreichend vielseitig, robust oder empfindlich. Darüber hinaus sind diese derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, verschiedene isobarische oder isomerische Lipidarten voneinander zu unterscheiden. Hier beschreiben wir eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode, die den Einsatz von Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiaeermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hier beschriebenen Protokolls:
1. Chloroform und Methanol sind giftig. Sie extrahieren effizient verschiedene Substanzen von Oberflächen, einschließlich Labor-Kunststoffundzeug und Ihre Haut. Behandeln Sie daher diese organischen Lösungsmittel mit Vorsicht, indem Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten vermeiden, die den Kontakt mit Chloroform und/oder Methanol beinhalten, Borosilikatglaspipett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Diskussionen. Wir würdigen das Zentrum für biologische Anwendungen der Massenspektrometrie und das Zentrum für Strukturelle und Funktionelle Genomik (beide an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) kanadas (RGPIN 2014-04482) und des Concordia University Chair Fund (CC0113) unterstützt. K.M. wurde vom Concordia University Merit Award unterstützt.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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