Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid
Summary
Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia’s en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.
Abstract
Diepgaande transcriptie heterogeniteit in anatomisch aangrenzende enkele cellen suggereert dat robuuste weefselfunctionaliteit kan worden bereikt door cellulaire fenotype diversiteit. Eencellige experimenten die de netwerkdynamiek van biologische systemen onderzoeken, tonen cellulaire en weefselreacties aan op verschillende omstandigheden bij biologisch zinvolle resolutie. Hierin leggen we onze methoden voor het verzamelen van enkele cellen uit anatomisch specifieke locaties uit en het nauwkeurig meten van een subset van hun genexpressieprofielen. We combineren lasercapture microdissectie (LCM) met microfluïde omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreacties (RT-qPCR). We gebruiken ook dit microfluïde RT-qPCR-platform om de microbiële overvloed aan darminhoud te meten.
Introduction
Het meten van de genexpressieprofielen van enkele cellen heeft uitgebreide fenotypische heterogeniteit in een weefsel aangetoond. Deze complexiteit heeft ons begrip van de biologische netwerken die weefselfunctie regelen, gecompliceerd. Onze fractie en anderen hebben dit fenomeen in vele weefsels en omstandighedenonderzocht 1,2,3,4,5,6. Deze experimenten suggereren niet alleen dat regulering van genexpressienetwerken ten grondslag ligt aan een dergelijke heterogeniteit, maar ook dat eeneencellige resolutie een complexiteit in weefselfunctie aanhet licht brengt die weefselresolutie niet waardeert. Slechts een kleine minderheid van cellen kan immers reageren op een specifieke aandoening of uitdaging, maar de impact van die cellen op de algehele fysiologie kan aanzienlijk zijn. Bovendien kan een systeembiologiebenadering die multivariate-methoden toepast op hoogdimensionale gegevenssets van meerdere celtypen en weefsels systeembrede behandelingseffecten verduidelijken.
We combineren LCM en microfluidic RT-qPCR om dergelijke datasets te verkrijgen. We nemen deze aanpak hier in tegenstelling tot het verzamelen van enkele cellen via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en het gebruik van RNA sequencing (RNA-seq) om hun transcriptoom te meten. Het voordeel van LCM ten opzichte van FACS is dat de exacte anatomische specificiteit van enkele cellen relatief en absoluut met LCM kan worden gedocumenteerd. Verder, terwijl RNA-seq kan meten meer functies die RT-qPCR, microfluïde RT-qPCR is minder duur en heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit7.
In dit representatieve experiment onderzochten we de effecten van opioïdeafhankelijkheid en naltrexon-neergeslagen opioïde terugtrekking op rattenneuronale, microglia- en astrocytengenexpressie in de centrale kern van de amygdala (CeA) en darmmicroflora overvloed4. Vier behandelingsgroepen werden geanalyseerd: 1) Placebo, 2) Morfine, 3) Naltrexon, en 4) Terugtrekking(Figuur 1). We ontdekten dat opioïdenafhankelijkheid de genexpressie niet wezenlijk veranderde, maar dat opioïde terugtrekking de expressie van ontstekingsgenen veroorzaakte, Tnf in het bijzonder. Astrocyten waren het meest getroffen celtype. Het darmmicrobioom werd ernstig beïnvloed door opioïde terugtrekking zoals aangegeven door een afname van de Firmicutes tot Bacteroides ratio, dat is een gevestigde marker van darmdysbiose8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eencellige biologie heeft aangetoond dat de heterogeniteit van cellulaire fenotypes en robuustheid van weefselfunctie. Deze bevindingen hebben inzicht gegeven in de organisatie van biologische systemen op zowel macro- als microschalen. Hier beschrijven we de combinatie van twee methoden, LCM en microfluïsche qPCR, om single-cell transcriptome maatregelen te verkrijgen die anatomische specificiteit en transcriptienauwkeurigheid tegen relatief lage kosten bieden (figuur 1). Onze groep hanteer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, en T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO’s.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
