Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı
Summary
Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.
Abstract
Anatomik olarak komşu tek hücrelerde derin transkripsiyonel heterojenlik, hücresel fenotip çeşitliliği ile sağlam doku işlevselliğinin sağlanabileceğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerin ağ dinamiklerini araştıran tek hücreli deneyler, biyolojik olarak anlamlı çözünürlükte çeşitli koşullara hücresel ve doku tepkilerini göstermektedir. Burada, anatomik olarak belirli yerlerden tek hücre toplama ve gen ekspresyonu profillerinin bir alt kümesini doğru bir şekilde ölçme yöntemlerimizi açıklıyoruz. Lazer yakalama mikrodizsikimi (LCM) ile mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiriyoruz. Ayrıca bağırsak içeriğinin mikrobiyal bolluğunu ölçmek için bu mikroakışkan RT-qPCR platformlarını kullanıyoruz.
Introduction
Tek hücrelerin gen ekspresyonu profillerinin ölçülmesi doku içinde kapsamlı henotibik heterojenite göstermiştir. Bu karmaşıklık doku fonksiyonlarını yöneten biyolojik ağları anlamamızı karmaşık hale getirmiştir. Grubumuz ve diğerleri birçok doku ve koşullarda bu fenomeni araştırdık1,2,3,4,5,6. Bu deneyler sadece gen ekspresyonu ağlarının düzenlenmesinin bu tür heterojenliğin altında yattığını değil, aynı zamanda tek hücreli çözünürlüğün doku düzeyinde çözünürlüğün takdir edemediği doku fonksiyonunda bir karmaşıklığı ortaya koyduğunu da göstermektedir. Gerçekten de, hücrelerin sadece küçük bir azınlık belirli bir durum veya meydan yanıt verebilir, ancak genel fizyoloji si bu hücrelerin etkisi önemli olabilir. Ayrıca, birden fazla hücre tipi ve dokulardan gelen yüksek boyutlu veri kümelerine çok değişkenli yöntemler uygulayan bir sistem biyolojisi yaklaşımı, sistem genelinde ki tedavi etkilerini açıklayabilir.
Bu tür veri kümelerini elde etmek için LCM ve mikroakışkan RT-qPCR’ı birleştiriyoruz. Burada floresan aktive hücre sıralama (FACS) yoluyla tek hücre toplama ve transkripsiyon ölçmek için RNA sıralama (RNA-seq) kullanarak aksine bu yaklaşımı almak. LCM’nin FACS’a göre avantajı, tek hücrelerin kesin anatomik özgüllüğünün LCM ile nispeten ve kesinlikle belgelenebilmiş olmasıdır. Ayrıca, RNA-seq rt-qPCR, mikroakışkan RT-qPCR daha az pahalı ve daha yüksek bir duyarlılık ve özgüllük7sahip daha fazla özellikleri ölçebilir iken .
Bu temsili deneyde, opioid bağımlılığı ve naltrekson-çökelmiş opioid çekilmesinin sıçan nöronal, mikroglia ve astrosit gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. Dört tedavi grubu analiz edildi: 1) Plasebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson ve 4) Çekilme(Şekil 1). Opioid bağımlılığının gen ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirmediğini, ancak opioid yoksunluğu özellikle Tnf olmak üzere inflamatuar genlerin ekspresyonunu tetiklediğini bulduk. Astrositler en çok etkilenen hücre tipiydi. Bağırsak mikrobiyomu derinden opioid çekilmesi tarafından bteroides oranı Firmicutes bir azalma ile belirtildiği gibi etkilenmiştir, hangi bağırsak dysbiosis kurulan bir belirteçtir8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücreli biyoloji hücresel fenotiplerin heterojenliğini ve doku fonksiyonunun sağlamlığını göstermiştir. Bu bulgular, biyolojik sistemlerin hem makro hem de mikro ölçeklerde organizasyonu hakkında bilgi verilmiştir. Burada, anatomik özgüllük ve transkripsiyonel doğruluk sağlayan tek hücreli transkripsiyonme ölçüleri elde etmek için iki yöntem, LCM ve mikroakışkan qPCR kombinasyonunu açıklıyoruz(Şekil 1). Grubumuz bir sistem biyolojisi yaklaşımı alır ve g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada sunulan çalışma NIH HLB U01 HL133360 JS ve RV, NIDA R21 DA036372 JS ve EVB ve T32 AA-007463 SJO’s destek jan Hoek verilen verildi yoluyla finanse edilmiştir.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
