将激光捕获微切片和微流体qPCR相结合，分析单细胞的转录曲线：阿片类药物依赖的系统生物学方法
Summary
该协议解释了如何使用激光捕获微解剖，以高精度和解剖特异性从杏仁核的中央核收集单个神经元、微胶质和星形细胞。此外，我们解释我们使用微流体RT-qPCR测量这些细胞转录的子集。
Abstract
在解剖学相邻的单细胞中，深刻的转录异质性表明，通过细胞表型多样性可以实现强大的组织功能。研究生物系统网络动力学的单细胞实验以生物有意义的分辨率显示细胞和组织对各种条件的响应。在这里，我们解释了我们从解剖学特定位置收集单个细胞的方法，并精确测量其基因表达特征的子集。我们将激光捕获微切切（LCM）与微流体反向转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）相结合。我们还使用这个微流体RT-qPCR平台来测量肠道含量的微生物丰度。
Introduction
测量单个细胞的基因表达特征已证明组织内具有广泛的球型异质性。这种复杂性使我们对控制组织功能的生物网络的理解复杂化。我们小组和其他人士在许多组织和条件1、2、3、4、5、6中探索了这种现象。这些实验不仅表明基因表达网络的调节是这种异质性的基础，而且单细胞分辨率揭示了组织功能的复杂性，而组织级分辨率却无法理解。事实上，只有一小部分细胞可能对特定条件或挑战做出反应，但这些细胞对整体生理的影响可能很大。此外，将多变量方法应用于来自多个细胞类型和组织的高维数据集的系统生物学方法可以阐明系统范围的处理效果。
我们将 LCM 和微流体 RT-qPCR 相结合，以获得此类数据集。我们在此采用这种方法，与通过荧光活性细胞分拣（FACS）和使用RNA测序（RNA-seq）测量其转录组进行采集单个细胞形成鲜明对比。LCM 优于 FACS 的优点是，单细胞的精确解剖特异性可以通过 LCM 相对和绝对进行记录。此外，虽然RNA-seq可以测量RT-qPCR的更多特性，但微流体RT-qPCR的成本较低，灵敏度和特异性7.
在这个具有代表性的实验中，我们研究了阿片类药物依赖和纳曲酮沉淀阿片类药物戒断对杏仁核（CeA）和肠道微生物丰度4中大鼠神经元、微胶质和星细胞基因表达的影响。分析了四个治疗组：1）安慰剂，2）吗啡，3）纳曲酮，和4）戒断（图1）。我们发现，阿片类药物依赖并没有实质性地改变基因表达，但阿片类药物的退出诱导了炎症基因的表达，尤其是Tnf。星细胞是受影响最大的细胞类型。肠道微生物群受到阿片类药物戒断的深刻影响，这表明血小杆菌与细菌的比降低，这是肠道肌营养不良8、9的既定标志。
Protocol
Representative Results
Discussion
单细胞生物学证明了细胞表型的异质性和组织功能的鲁棒性。这些发现使人们对宏观和微观尺度生物系统的组织提供了见解。在这里，我们描述了两种方法的组合，LCM和微流体qPCR，以获得单细胞转录测量，提供解剖特异性和转录精度在相对较低的成本（图1）。我们小组采用系统生物学方法，经常测量同一动物中的多个组织。我们认为这些方法在确定生物系统在转录一级如?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这里提供的工作是通过NIH HLB U01 HL01 HL01 HL133360授予JS和RV，NIDA R21 DA036372授予JS和EVB，T32 AA-007463授予扬霍克支持SJOS。
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
