遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

1. トータルRNA抽出と精製 注:この方法は有害な揮発性有機溶剤の使用を含むので、常にヒュームフードの下で動作します。実験を開始する前に、50°Cのヒートブロックでヌクレアーゼフリー水のミクロフュージチューブを事前に温めます。このヌクレアーゼを含まない水は、ステップ1.8のスピンカラムからRNAの総量を溶出するために使用されます。 別々にサンプルを粉砕し、それぞれに少なくとも3つの生物学的複製を有し、液体窒素中で予冷された殺菌モルタルおよび害虫を用いて微粉末にする。 液体窒素に浸した小さな金属ヘラを使用して粉末サンプルをすくい、2.0 mLヌクレアーゼフリーマイクロフュージチューブに粉末サンプルを入れ、液体窒素にもあらかじめ浸します。バッチRNA抽出(STOP POINT)に割り当てられた日まで、すぐに超低温冷凍庫(-80°C)にサンプルを保管してください。注:種子サンプルは、脱フスキングの有無にかかわらず、細かい粉末に粉砕することができます。米では、huskには粉砕プロセス中に役立つシリカが含まれているため、デフスキングなしでサンプルを日常的に粉砕しています。注意:このステップは、厳しく極低温条件下で迅速に行う必要があります。自動化のための1つの選択肢は、RNAの劣化と品質劣化を最小限に抑えるために極低温ボールミルを使用してサンプルを粉砕することです。 元の粉末サンプルの約200mgを用いて粗RNA抽出物を得る。750 μLのRNA抽出バッファー(100 mMトリ、pH 8.0、150 mM LiCl、50 mM EDTA、1.5% SDS、1.5%2-メルカプトエタノール)、および500 μLのフェノール:クロオホルム:24を含むヌクレアーゼフリーマイクロフュージチューブに各サンプルを個別に加えます。 高速に設定されたマルチチューブボルテックスミキサーを使用して、室温で5分間、すべてのサンプルを同時に混合します。すぐに2分間氷の上にすべてのチューブを保ちます。注意:特にフェノール、クロロホルム、その他の有機溶剤を含むすべてのステップのために、常にヒュームフードの内側で動作します。理想的には、1つのベンチトップ遠心分離機、渦ミキサー、マルチチューブ渦ミキサー、およびマルチチューブロータリーミキサーを収容できる広いヒュームフードを使用してください。 粗RNA抽出物を14,000xgで遠心分離して10分間、破片gから分離します。このセクションで同じ設定で、すべての遠心処理手順を実行します。 上清の約800 μLを、400 μLの1.2 M NaClと700 μLのイソプロパノールを含む新しい2.0 mLマイクロフュージチューブに移します。反転5倍で溶液をやさしく混ぜます。 通常の(-20°C)または超低温冷凍庫(-80°C)で、少なくとも1時間(または一晩)にインキュベートすることによってRNAを沈殿させる。停止または一時停止ポイント:ちょうど数時間一時停止するために、通常の-20°C冷凍庫にサンプルを保ちます。夜間またはより長い停止点については、極低温冷凍庫(-80°C)にサンプルを保管してください。 18,800 x gで15分間遠心分離により粗RNAペレットを得る。上清を捨て後、ミニキット(材料表)を用いてカラム精製により粗RNAペレットを精製する。 ペレットを RLT バッファーの 450 μL を新たに調製した 450 μL に溶解します(使用前に、RLT バッファーの 100 mL あたり β-メルカプトエタノール 100 μL を加え、新鮮な毎日を調製します)。少なくとも5分間のマルチチューブ渦ミキサーで室温で全てのチューブを混合することにより、すべてのペレットの溶解を高めます。 2 mLのコレクションチューブで紫色のミニスピンカラムを通過させることにより、溶存RNAペレットを精製します。9,000 x gで1分間室温で遠心分離し、紫色のミニスピンカラムを捨てます。 2 mLの回収チューブで、クリアしたライセートに0.5ボリュームの絶対エタノール(約225μL)を加えます。同じプラスチックチップを使用して、溶液を数回上下にピペットで混ぜます。 2 mLのコレクションチューブを用いて溶液をピンクのミニスピンカラムにすぐに移すことで、精製したRNAを回収します。ピンクミンスピンカラムのシリカ膜にRNAを集めるために15sの9,000 x gの遠心分離機。流れを廃棄し、15 sの9,000 x gで遠心分離により350 μLのバッファーRW1でRNAを洗浄します。 80 μLの希釈DNase 1(DNaseセットを使用して凍結DNaseストック50 μL + 350 μLのRDD)を膜に直接加えて、汚染ゲノムDNAを除去し、少なくとも15分間室温でインキュベートして消化します(ポーズポイント)。 350 μLのRW1を加えてDNase 1を洗い流し、9,000 x gで15秒回転します。新しい2 mLコレクションチューブに移し、9,000 x gで回転して2分間乾燥させます。 乾燥したスピンカラムを新しい1.5 mLヌクレアーゼフリーコレクションチューブに移します。50 μLのヌクレアーゼフリー水(50°Cで前温め)を加え、50°Cのヒートブロックで3分間インキュベートすることにより、精製されたRNA抽出物の溶出プロセスを開始します。 インキュベーション後、9,000 x gで遠心分離して全RNA抽出物を1分間溶出し、すべてのサンプルを氷の上に置きます。 それぞれのメーカープロトコルを使用して、ナノドロップとBioAnalyzerで適切な希釈液(通常は1:10)を実行することで、RNA抽出物全体の量と品質を決定します。RNA抽出物は、少なくともRIN値が8.0で、濃度が50ng/μLである必要があります。ストップポイント: 使用するまで-80 °Cでサンプルを保管してください。 2. cDNA合成に続いてcRNA転写と標識 注: このステップは24サンプルを同時に処理するのに適しています。ステップ全体が1日で連続して行われるのが推奨されますが、オプションの停止ポイントと一時停止ポイントが特定されます。以下のステップを開始する前に、80°C、65°C、および37°Cで3マイクロフュージチューブヒートブロックを事前に温めておくようにしてください。これらの温度設定は、以下の手順で説明したように変更されます。たとえば、37 °C のヒートブロックは、スパイク ミックスの準備後 (または既に準備されている場合) 40 °C に設定されます。メーカーの指示に基づいて、低入力クイックアンプ遺伝子発現ラベリングキット(表を参照)を使用して、1色のスパイクミックス、T7プロモーターミックス、cDNAマスターミックスを準備します。この調製物は、開始RNA抽出物の量に依存し、これは通常、全RNAの場合は10〜200 ng、ポリARNAの場合は5ngの範囲である。マイクロアレイハイブリダイゼーション2の出発物質として、また以下に説明する方法については、50ngの全RNAを日常的に使用しています。24サンプルのマスターミックスを準備する際に、ピペッティングバリエーションを考慮して2つの余分な反応を追加します。このステップでは、ヌクレアーゼを含まないマイクロフュージチューブとヌクレアーゼを含まない水を常に使用してください。 高収率のため、通常、50〜100 ngの範囲内に収まるようにRNA抽出物を100倍希釈する。ステップ1.9のRNA定量結果に基づいて、精製されたRNA抽出物を1.5 mLマイクロフュージチューブ内のヌクレアーゼフリー水に1μL加えて1:100希釈します。ナノドロップを使用して、この希釈の実際の濃度を決定します。 1.5 mLマイクロフュージチューブ内の各RNAサンプルを2回目に希釈して、最終体積1.5μLの合計RNAの50ngを作ります。 メーカーの指示に基づいてスパイクミックスを準備します。このステップは、2019年のプフフェルトらにも要約されている。37 °Cのヒートブロックを使用します。1色のスパイクミックスの1番目と2番目の希釈を超低温冷凍庫(-80°C)に入れ、8回の凍結/解凍サイクルを繰り返すだけです。 新鮮な新鮮な3番目と4番目の希釈を毎日準備します。使用前に氷の上にスパイクミックスの3番目と4番目の希釈を解凍して保存してください。注:スパイクミックスが準備されていた(または以前に準備された場合)37°Cヒートブロックの温度を40°Cに変換してください。 T7プロモーターミックスを準備し、使用する前に氷の上に保存します。24 サンプルでは、次の方法で十分です。T7プロモータープライマーの20.8 μL+ 26.0 μL のヌクレアーゼフリー水= 総容積T7プロモーターミックスの46.8 μL ステップ2.1から1.5 μLの50 ng RNAサンプルを含むマイクロフュージチューブにT7プロモータープライマーミックス(ステップ2.3)を1.8 μL加えます。ピペットで適切に混合します。65°Cのヒートブロックで10分間インキュベートしてRNAテンプレートプライマーミックスを変性させ、次のステップに備えてマイクロフュージチューブを氷の上に置きます。 テンプレートプライマーミックス(ステップ2.4)を変性しながら、メーカーの指示に基づいて、80°Cで5xファーストストランドバッファを少なくとも4分間事前に温めます。 Table of Materials以下は24の反応のために十分です:52.0 μL のプレウォームド 5x ファーストストランドバッファ(ステップ 2.5)+ 26.0 μL 0.1M DTT+ 10 mM dNTP ミックスの 13.0 μLRNase ブロックミックスの + 31.2 μL= 122.2 μLの全容cDNA合成マスターミックス 氷の上の各成分を解凍します。各成分を穏やかなピペットで混ぜます。マスターミックスは使用前に室温で保管してください。注意:RNaseブロックミックスは、使用後すぐに-20°Cの冷凍庫に戻す必要があります。 氷上のRNAテンプレートプライマーミックス(ステップ2.4)と遠心分離機を室温で短時間取り除き、すべての内容物をマイクロフュージチューブの底まで回転させます。各チューブにcDNAマスターミックス(ステップ2.5)の4.7 μLを分配し、上下にピペットを入れて慎重に混合します。すべてのコンポーネントが追加されたときの総容量は8.0 μLである必要があります。 40°CのヒートブロックでcDNAを2時間合成します。2時間のインキュベーション中に、65°Cのヒートブロックの温度を、不活性化に備えて70°Cに移します(ステップ2.7)。オプションのポーズポイント:サンプルを-80 °Cで一晩保管します。実験は、熱不活性化の翌日に継続することができる(ステップ2.7)。 各チューブを70°Cのヒートブロックで15分間インキュベートし、RNaseブロックミックスを加熱不活性化します。すぐに氷の上にチューブを移し、少なくとも5分間インキュベートします。 サンプルが5分間氷上にある間(ステップ2.7)、すぐに転写マスターミックスを準備します。すべてのコンポーネントは室温で組み合わせることができますが、氷上のコンポーネントを解凍することができます。24 サンプルでは、次の方法で十分です。ヌクレアーゼフリー水 19.5 μL+ 83.2 μL 5x転写バッファー+ 0.1M DTTの15.6 μL+ 26.0 μL の NTP ミックス+ 5.5 μL の T7 RNA ポリメラーゼ ブレンド+ 6.2 μL の シアニン 3-CTP (Cy3)= 総容積の156.0 μL の転写マスターミックス注意:T7 RNAポリメラーゼブレンドは-20°Cのフリーザーに保管し、使用後すぐに戻す必要があります。また、Cy3は光に敏感である。したがって、混合(ステップ2.9)と分配(ステップ2.10)は、低照度条件で行う必要があります。このために、我々は通常、ラボベンチの真上の任意の光をオフにします。 チューブを急激な加熱および冷却(ステップ2.7)に供した場合、マイクロ遠心分離機を用いて各サンプルの内容物を簡単にスピンダウンし、各マイクロフュージチューブの底面にある液体をすべて回収します。6 μLの転写マスターミックス(ステップ2.8)を加え、上下に軽くピペットを加えます。この反応の総体積は、この段階で16μLでなければなりません。40°Cで2時間インキュベートし、Cy3標識cRNAを生成します。任意停止点:管は転写後-80 °Cで貯えることができる。 cRNAを発生させながら(ステップ2.9)、ヒートブロックの温度を55°Cに設定します。ヒートブロックにヌクレアーゼを含まない水のマイクロフュージチューブを少なくとも1つ加えます。このヌクレアーゼを含まない水は、精製されたcRNAの溶出に使用されます。 cRNA転写および標識後、RNeasyミニキットを使用して標識されたcRNAをステップ3で詳述したとおりに精製します。 3. cRNA精製 RNeasy ミニキットを使用してラベル付き cRNA を精製します (材料表を参照)。製造元の指示に基づいてバッファを準備します。例えば、バッファー RPE は、濃縮された形でキットに供給されます。使用前に、分子生物学グレードの絶対エタノール(96-100%)を4巻加えます。 各サンプルに84μLのヌクレアーゼフリー水を加えて、総体積を100μLに調整します。その後、各チューブに350 μLのバッファRLTと250 μLの絶対エタノールを加えます。ピペットで十分に混ぜます。 各混合物の700 μLを2 mLのコレクションチューブが付いているミニスピンカラムに移します。標識されたcRNAを膜上に集め、4°Cで7,534 x gで30sの遠心分離を行います。フロースルー液体を廃棄します。 各サンプルを500 μLのバッファRPEで洗浄します。前の手順と同様に、遠心分離機と廃棄フロースルー。この手順を 1 回繰り返してから、次の手順に進みます。 ミニスピンカラムを新しいコレクションチューブに移します。ステップ3.3のように遠心分離でサンプルを乾燥させます。 キットに付属のヌクレアーゼフリー1.5 mLマイクロフュージチューブにミニスピンカラムを移します。30 μLのヌクレアーゼフリー水(55°Cで事前に温める)を膜フィルターに直接加えて、各標識cRNAサンプルを直接膜フィルターに加えます。55°Cのヒートブロックで60sのインキュベートを行い溶出を強化します。 7,535 x gで30 sの室温で遠心分離によって標識されたcRNAを収集する。スピンカラムを捨てて、各マイクロフュージチューブを閉じます。すぐに各チューブを氷の上に置きます。任意停止点:サンプルは溶出後-80 °Cで貯えることができる。 マイクロアレイ機能を使用してナノドロップでcRNAを定量化します。サンプルをRNA-40にセットします。以下の値を取得し、スプレッドシートに記録: シアニン 3 色素濃度 (pmol/μL),RNA 吸光度比 (260 nm/280 nm), および cRNA濃度 (ng/μL).ストップポイント:読み取り後、cRNAサンプルを-80°Cですぐに保存します。 pRNA収率と特定活性を、プフフェルトら 20192.に詳述されているように計算する。 4. マイクロアレイのハイブリダイゼーションとスキャン 注:このステップは3-4時間しかかからず、昼食後に24サンプルのハイブリダイゼーションを開始することができます。1人のオペレータは4枚までのスライド(32サンプル)まで快適に走ることができる。翌日の朝はマイクロアレイスライドの洗浄とスキャンに割り当てられます。その後、2日目の午後に追加の実行を実行できます。このステップは、すべてのサンプルがハイブリダイズされ、スキャンされるまで繰り返されます。サンプルがマイクロアレイ分析を妨げる色付きの顔料で汚染されないように、スライドの処理と処理に無色のパウダーフリーラテックス手袋を使用することを強くお勧めします。市販のマイクロアレイとは別に、 以下のカスタム配列は、当社のグループによって設計されており、Agilentから注文可能です: 大麦のための注文コード 028827 (Hordeumvulgare), 054269 米のための (TriticumaestivumOryzasativa潜水艦ジャポニカ), 054270 米のための (Oryzasativaサブスインチカ) と 048923 遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットを使用してマイクロアレイハイブリダイゼーションを実行します(材料表を参照)。メーカーの仕様2に従って10倍のブロッキングエージェントを準備します。アリコート200 μLの部分に10xブロッキング剤を、使用するまで-20°Cで保存します。各アリコートは最大40のハイブリダイゼーションに十分であり、2ヶ月まで安定しています。 マイクロアレイハイブリダイゼーションに割り当てられた日に、氷上の10xブロッキング剤の200μLアリコートを解凍します。また、ハイブリダイゼーションオーブンを65°Cに予温し、cRNA断片化時に使用するためにヒートブロックを60°Cに予め温めます。 製造元2の説明に従って、各サンプルに対してフラグメンテーション ミックスを準備します。私たちの研究室では、8パックマイクロアレイでのハイブリダイゼーションに600ngの線形増幅Cy3標識cRNAを日常的に使用しています。この場合、以下のリストは、サンプルごとのフラグメンテーション ミックスのコンポーネントをまとめたものです。600 ngの直線的に増幅されたcRNA、シアニン3標識+ 5 μLの10xブロッキング剤ヌクレアーゼを含まない水で24μLに音量を調整+ 25x フラグメンテーション バッファの 1 μL= 総ボリュームフラグメンテーションミックスの25 μL 渦ミキサーを使用してサンプルを穏やかに混ぜます。マイクロ遠心分離機を使用して、すべてのサンプルを簡単に回転させます。 60°Cヒートブロック内のすべてのサンプルを正確に30分間インキュベートし、氷上の各チューブを1分間すぐに冷却してから、すぐに次のステップに進みます。 断片化反応を完全に停止するには、各チューブに2倍のGExハイブリダイゼーションバッファHI-RPMを追加します。上下にピペットを入れて軽く混ぜ、混合中に泡を導入しないように細心の注意を払ってください。我々は、8パックマイクロアレイフォーマットの断片化反応を止めるために、25μLのハイブリダイゼーションバッファを日常的に使用しています。 遠心分離機周囲室温で15,750 x gで1分間すべてのチューブ。すべてのチューブを素早く氷の上に置き、各サンプルをできるだけ速くロードします。 17時間の夜間インキュベーションのためにラボを出る前に、ビデオに詳述されているようにハイブリダイゼーションアセンブリ2を準備する。 クリティカルステップ:各ハイブリダイゼーションミックスを移し、各ガスケットの中央でゆっくりと分配し、分配中に気泡を導入しないように細心の注意を払って観察します。8パックマイクロアレイ形式では、44 μLのハイブリダイゼーションミックスを日常的に使用しています。また、未使用のウェルに44 μLの1xハイブリダイゼーションバッファを配置します。 ガスケットスライドの上に正しい方向のマイクロアレイスライドを直ちに置きます。これは、液体をこぼさないために非常に慎重に行う必要があります。ハイブリダイゼーションアセンブリをしっかりと閉じ、回転させて、永久気泡が導入されていないかどうかを確認します。すべての気泡はガスケットスライド内で移動する必要があります。 ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリをハイブリダイゼーションオーブン回転器に入れます。2x GExハイブリダイゼーションバッファを使用する場合は、回転速度を10rpmに設定し、65°Cでハイブリダイズして17時間をとってください。 遺伝子発現洗浄バッファーキットを使用してハイブリダイズされたマイクロアレイを洗浄します(材料表を参照)。メーカーの指示に基づいて遺伝子発現洗浄バッファー1と2を準備します 2.20% Triton X-102 の 2 mL を両方のバッファーに追加します (純粋に任意ですが、マイクロアレイの洗浄アーティファクトの発生率を減らすために強く推奨)2. 前の出版物2で詳述したように3つの洗浄室アセンブリを準備する。各洗浄室の詳細は以下に表に記載されている(表1)。 1L試薬ボトル内の洗浄緩衝液1のアリコート500mLを、周囲室温で放置する。1個のL試薬ボトルを追加準備し、最初のチャンバーから洗浄バッファーを保存するために「洗浄バッファー1再利用」とラベルを付けます。さらに、試薬ボトル内の洗浄緩衝液2のアリコート500mLを、一晩37°Cの水浴中にインキュベートする。注: 手順 4.9 ~ 4.11 を準備せずにラボを終了しないでください。彼らは、次の日に洗浄ステップのために必要です。 翌日、表2に詳述されているように洗浄バッファを準備する。各皿を対応するバッファの4分の3に充填します。各洗浄バッファーは4-5スライドまで良いです。 ちょうど17時間のハイブリダイゼーションの後、1つのハイブリダイゼーションチャンバーを取得し、前の出版物2で詳述したように、糸くずのない紙が並ぶラボベンチで分解する。 クリティカルステップ:マイクロアレイサンドイッチをディッシュ1に移します。マイクロアレイバーコードが傾斜した位置で上向きになっていることを確認し、スライド全体をバッファーに入れないようにします。各マイクロアレイスライドを両端から取り扱い、スライドのアクティブな側面に触れないようにします。 鉗子2を使用して2つのガラススライドを分離します。ガスケットをディッシュ1の底にそっと落とすと同時に、マイクロアレイスライドが次のステップに向けてしっかりと保持されるようにします。 クリティカルステップ:マイクロアレイスライドを横にゆっくりと持ち上げ、前の出版物2で詳述したように、皿2のマイクロアレイラックにすぐに移します。マイクロアレイスライドが空気にさらされることは非常に重要です。 8 つのスライドがラックに入るまで、ステップ 4.13 と 4.14 を繰り返します。マイクロアレイスライドをラックに沿って均等に分散します。このステップは、最大4枚のスライドに対して、1人のオペレータが無援助で行うことができます。ラックホルダーを取り付け、ディッシュ2のセットアップ全体を最初の磁気攪拌機に移します。1分間ゆっくりかき混ぜます。 1分間攪拌しながら(ステップ4.14)、ミニ37°Cインキュベーターからディッシュ3を移し、2番目の磁気攪拌機の上に置きます。洗浄バッファー 2 (37 °C の水浴から) を皿 3 にそっと置きます。注ぎ込み中は泡の形成を避けてください。 1分撹拌が完了した後(ステップ4.14)、スライドラックをディッシュ2からゆっくりとゆっくりと持ち上げ、ディッシュ3に移します。ラックホルダーを取り外し、1分間かき混ぜます。 スライドラックを皿3からゆっくりとそっと持ち上げます。バッファー液滴の形成を避けるようにしてください2.糸くずのない紙にそっと触れて、各スライドの側面を乾かします。各ブロット乾燥スライドをスライドボックスに入れ、すべてのマイクロアレイスライドがスライドボックスに入るまでステップ4.16を繰り返します。約15分間乾燥します。オプションの停止点 各マイクロアレイスライドをスライドホルダーに配置し、バーコードが上向きであることを確認します。メモ:マイクロアレイ室内のオゾンレベルは50 ppb(100 μg/m3)以下にする必要があります。これは純粋に任意ですが、強くお勧めします:オゾンバリアスライドカバーを使用して、シアニン染料のオゾンによる劣化を避けてください。 組み立てたスライドホルダーをスキャンカルーセルに入れる。バーコード番号に基づいてサンプルを順番にロードします。前の資料2で詳しく説明したように、マイクロアレイ スキャナ (資料表を参照) を使用して、スライドを直ちにスキャンします。 実行後、前の文書2で詳しく説明したように、データを特徴抽出と QC 検証の対象にします。