Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.
Nos últimos anos, os pericitos cerebrais tornaram-se o foco de uma extensa pesquisa em biologia vascular e patologia. A importância dos pericites na formação e fisiologia da barreira hematoencefálica é demonstrada agora mas sua base molecular permanece pela maior parte desconhecida. Como o papel fisiopatológico dos pericitos cerebrais em distúrbios neurológicos é intrigante e de grande importância, os modelos in vitro não são apenas suficientemente apropriados, mas também capazes de incorporar diferentes técnicas para esses estudos. Vários métodos têm sido propostos como modelos in vitro para a extração de pericitos cerebrais, embora um protocolo livre de antibióticos com alta produção seja desejável. Mais importante ainda, um método que aumentou a produção por extração reduz o uso de mais animais.
Aqui, propomos um método simples e eficiente para extrair pericitos cerebrais com produção suficientemente alta. A homogeneação do tecido cerebral do rato é misturada com uma solução BSA-dextran para a separação dos detritos do tecido e pelota microvascular. Propomos uma separação de três etapas seguida de filtragem para obter uma filtragem rica em micronavios. Com este método, a quantidade de fragmentos microvasculares obtidos de 10 camundongos é suficiente para semeadura 9 poços (9,6 cm2 cada) de uma placa de 6 poços. Mais interessante com este protocolo, o usuário pode obter 27 poços ricos pericyte (9,6 cm2 cada) na passagem 2. A pureza das culturas pericítonas é confirmada com a expressão de marcadores clássicos pericytes: NG2, PDGFR-β e CD146. Este método demonstra uma ferramenta in vitro eficiente e viável para estudos fisiológicos e fisiopatológicos sobre pericitos.
Os pericitos cerebrais são um componente essencial da unidade neurovascular (NVU), que compreende uma unidade funcional com as células endotélias cerebrais da barreira hematoencefálica (BBB), células gliais, matriz extracelular e neurônios. Os pericitos são uma parte vital no funcionamento regulado do sistema nervoso central (SNC), pois servem como uma das interfaces para a troca de informações moleculares e celulares.
Os pericitos cerebrais são encaixados no lado abluminal das microvasos cerebrais, e são essenciais para estabelecer1 e manter2 a fisiologia BBB. Vários trabalhos recentes também destacaram o papel dos pericitos cerebrais na angiogênese3 e maturação dos vasos4,morgênese endotelial5 e sobrevivência6,e no controle do metabolismo do colesterol cerebral7. É importante ressaltar que a desregulação em qualquer um desses processos são características etiológicas de doenças neurodegenerativas.
De fato, os pericitos são uma necessidade funcional para o funcionamento normal do BBB e sua proteção contra a progressão de várias doenças neurológicas. Fisiologia degeneração e perda de pericitos são denominadores comuns na progressão da doença de Alzheimer8, perda neuronal durante a disfunção da matéria branca9,esclerose múltipla10, encefalopatia séptica11, acidente vascular cerebral isquêmico fase aguda12 e em outras doenças neurológicas. Pericitos também são fundamentais na metástase tumoral13. Curiosamente, pericites também foram mostrados para exibir um papel de resgate após trauma neurológico e distúrbios: na remielinação no cérebro1, acidente vascular cerebral isquêmico, lesão medular14 e promover a angiogênese15. A suscetibilidade dos pericytes para reforçar a manifestação fisiopatológica de traumas neurológicos e distúrbios torna-os um potencial alvo terapêutico16.
Modelos de pesquisa in vitro de pericites no BBB são ferramentas importantes para realizar extensos estudos. Esses modelos fornecem uma plataforma para estudos mais elaborados, representando modelos de trabalho do BBB e muito mais. Por exemplo, esses modelos podem ser usados para entender a fisiologia celular dentro de pericitos e entre outros tipos de células do NVU. Além disso, os modelos in vitro são ferramentas de investigação em primeira mão para testar a influência farmacológica de novas drogas e moléculas em pericites. Esses modelos também podem ser usados para entender o papel fisiopatológico dos pericytes em relação a distúrbios neurológicos. No entanto, o desenvolvimento de modelos in vitro requer maior produção para permitir a liberdade experimental. Estes modelos devem ser fáceis e rápidos, e reduzir o número de animais experimentais utilizados. Além disso, a capacidade de desenvolver esses modelos em modelos de cultura de células duplas e triplas é desejável.
Há muitos protocolos que foram desenvolvidos. Os protocolos propostos por Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, e Crouch e Doetsch21 são abordagens louváveis que satisfazem a maioria das necessidades. Todos esses métodos produzem resultados eficazes, mas a dependência de um grande número de animais experimentais continua a ser um denominador comum para esses protocolos. Portanto, torna-se obrigatório desenvolver um método de alta produção que possa isolar e purificar pericites com a máxima eficiência possível. Neste protocolo, a pureza das células obtidas após uma segunda passagem é verificada com vários marcadores pericantes. Verificamos o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas Receptor-β (PDGFR- β), que é usado como um marcador clássico de pericites17,e para NG2 (antígeno neuronil-glial 2), que é um marcador de pericyte mediada morgênese vascular22 e vascularização23. Também verificamos o cluster de diferenciação 146 (CD 146), que tem sido relatado como uma das moléculas expressas nos pericitos17,18.
Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de pericitos primários de camundongos (tipo selvagem ou transgênicos) que irá satisfazer todos os requisitos acima mencionados com alta produção. Empregamos um método de proliferação livre baseado em antibióticos e imunopanning para os pericitos cerebrais primários, que provará ser um modelo eficiente para a realização de estudos in vitro.
Os pericitos cerebrais são parte integrante da NVU e desempenham um papel ativo na indução e manutenção do BBB24. Da mesma forma, o papel dessas células nas diferentes doenças neurodegenerativas e patologias vasculares é intrigante. Assim, um modelo eficiente de células pericytes primárias de alta produção fornecerá uma plataforma eficiente para estudos in vitro.
Existem vários protocolos que foram propostos para o isolamento dos pericitos primários (Figura 4). Tigges et al.17 sugeriram um método que inclui tecido corticano com meninges. Esta abordagem é a tenderização do tecido de 6 camundongos (uma digestão de 37 °C, 70 min com enzimas papaina/DNAse), seguida por um passo de desintegração através de agulhas 21 G e 18 G. Este protocolo sugere uma separação de uma etapa (centrífuga em 22% bsa / pbs solução) que produz pelo menos 2 colágeno eu revestido poços de uma placa de 6 poços. As células são mantidas no meio de crescimento de células endotélias (ECGM) até a passagem 3 e mais tarde no meio de crescimento pericyte (PGM) para células de passagem para promover a proliferação de pericytes. Em uma outra aproximação similar, Chen eoutros18 propuseram a dissociação do tecido cortando o tecido com uma lâmina de lâmina e uma digestão esterilizadas do tecido com colagem/DNase para 90 min em 37 °C. Após a separação em uma etapa (centrífuga em 22% BSA) das células, a camada de mielina é removida e a pelota é lavada duas vezes no ECGM. Os microvasos são banhados em 3 poços de colágeno eu revesti pratos de 6 poços. Depois de atingir a confluência, as células são passagens duas vezes e depois mantidas em PGM. No final, se as células são passadas em proporção de 3, podemos obter 27 poços de placas de 6 poços apenas no uso de 10 camundongos no início do protocolo.
Em Thomsen et al., os autores sugerem isolamento de pericitos cerebrais através de uma digestão enzimática de duas etapas19. Meninges e matéria branca são removidos, e amostras de cérebro são cortadas em pedaços pequenos. As partes do tecido submetem-se à primeira reação da enzima na colagem/DNase I para 75 min em 37 °C, seguindo uma etapa da separação em 20% BSA. A pelota é coletada e digerida ainda mais em colagenase/dispase/DNase I por 50 min a 37 °C. Esta etapa é seguida pela separação do microvessel em um gradiente de Percoll de 33% e lavado mais uma vez. Os microvasos são semeados em pratos de colágeno IV/fibronectina revestidos de 35 mm. A proliferação de pericitos é favorecida por 10% FCS e sulfato de gentamicina no DMEM por 10 dias. Em outra abordagem de digestão de enzimas de duas etapas, Yamazaki et al. sugerem picar o tecido extisizado no Frio DMEM20. Na primeira reação enzimática, as amostras são tratadas com colagem/DNase I por 75 min a 37 °C. Após uma centrifugação de um passo, a pelota é novamente lavada uma vez e uma segunda reação enzimática é iniciada em colagem/dispase por 60 min a 37 °C. Após uma separação de uma etapa, a pelota é resuspensa e centrífuga em 22% de solução BSA. Finalmente, a pelota microvascular é resuspendida e banhada em uma placa de 6 poços. Para 5 cérebros do rato, 1 poço de uma placa de 6 poços pode ser banhado. Para obter os pericites, as culturas endotelimais são passagens três vezes enquanto mantidas em célula endotelial cerebral de camundongo (mBEC) médio II. Crouch e Doetsch20 sugerem método de purificação de pericyte pela FACS. Amostras de tecido do córtex e zona ventricular-subventricular do cérebro do rato são microdissecadas e picadas completamente com um bisturi. Após a incubação de enzimas colagenase/dispase por 30 min a 37 °C, o tecido digerido é separado da mielina e detritos centrífugas em uma solução de 22% v/v Percoll. A suspensão celular é então incubada em anticorpos fluorescentes conjugados para análise e classificação facs. As células classificadas são banhadas em poços revestidos de colágeno de 24 pratos bem. Sugere-se que um córtex produz células suficientes para um revestimento em 1 poço de placa de 24 poços.
Mesmo se produtivo, estes métodos vêm com diversas limitações, do uso do número elevado de animais para a isolação do único grupo a uma quantidade muito limitada de saída.
Durante o desenvolvimento deste protocolo proposto, fomos bem sucedidos na obtenção de alta produção: 9 poços de uma placa de 6 poços de apenas 10 camundongos. Para este fim, a remoção de meninges garante a remoção de um passo de grandes vasos do tecido. O moedor de tecido Dounce é mais apropriado para tecidos moles, como o cérebro. Ele também garante a redução da amostra com o pilão solto, homogeneização com o pilão apertado, e evita danos celulares desnecessários. Um dos principais objetivos nos protocolos de cultura celular primária é o desperdício mínimo de tecido e a recuperação prolongada da vasculatura cerebral. No protocolo apresentado, isso é alcançado por centrífuga repetitiva do tecido dextran-BSA infundido homogeneizar. Uma abordagem de centrifugação de três etapas ajuda a recuperar grandes quantidades de vasculatura do tecido homogeneado. Isto fornece uma recuperação 3x realçada de microvessels. Após a separação, a filtragem é o próximo passo essencial, o que favorece a exclusão de células musculares lisas associadas a grandes vasos. Como mencionado antes de uma combinação de enzimas diferentes foi proposta para a digestão enzimática. Enquanto dnase e colagem/dispase são usados para reduzir aglomerados de células e isolar células únicas, respectivamente, é muito importante prevenir a morte celular em um ambiente tão invasivo e isso é impedido pelo TLCK, o que aumenta assim o rendimento final. Inicialmente, a primeira passagem é permitida crescer um monolayer endothelial, que suporte mais tarde o crescimento de pericites unidos no unilayer. Desde que a sobrevivência de pilhas endoteliis preliminares é reduzida em cima da passagem, realça a probabilidade para a recuperação do pericyte. Além disso, este protocolo emprega outra passaging que garante evitar a contaminação de células endotélias. Note-se que, com um maior número de células de P2, a dependência de uma maior passagem das células é reduzida. Além disso, reduz a possibilidade de crescimento pericito ser ultrapassado por células musculares lisas, que proliferam em taxa muito maior.
A fim de alcançar uma saída mais elevada, existem várias etapas que são críticas e devem ser executadas com precisão no que diz respeito à temperatura e ao tempo. A mistura de tecido homogeneado em BSA-dextran deve ser rápido. A dissociação da pelota após as etapas da centrífuga deve ser rápida impedir a morte da pilha. Além disso, 33 min de digestão enzimática deve ser feito com precisão e cuidado. Uma das limitações para este protocolo é a duração de 7-8 dias que unilayer endotelial é permitido crescer e facilitar mais o crescimento dos pericytes. Evidentemente, o isolamento de micronavios é btter, o crescimento da unilayer é mais rápido, e, portanto, há um aumento do número de pericites. Recomenda-se não usar menos de 10 camundongos em cada extração para garantir um número adequado de frações microvasculares para suportar ainda mais o crescimento do pericito. Se os pontos acima mencionados forem seguidos com cuidado, a densidade celular desejada para a cultura do pericito cerebral pode ser facilmente alcançada.
Os modelos in vitro fornecem uma plataforma viável para o desenvolvimento de modelos derivados para obter mais informações sobre a relevância fisiopatológica e comunicação entre as outras células do NVU durante distúrbios neurológicos. Pericites isolados podem ser incorporados em uma cultura bicelular (com células endotélias ou gliais) e cultura tricelular (células endotélias e gliais) modelos. O desenvolvimento desses modelos não foi discutido aqui. Para concluir, este protocolo fornece uma abordagem para o isolamento das células primárias com maior produção e uma melhor plataforma para pesquisain vitro relacionada à biologia do pericyte cerebral.
The authors have nothing to disclose.
A LT e a FG foram concedidas pela Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) no âmbito do Programa Conjunto da UE – Pesquisa de Doenças Neurodegenerativas (JPND) para o projeto SNOWBALL.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |