Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.
In den letzten Jahren sind zerebrale Pericyten in den Fokus umfangreicher Forschungen in der Gefäßbiologie und Pathologie geraten. Die Bedeutung von Pericyten in der Bildung und Physiologie von Blut-Hirnbarrieren ist nun nachgewiesen, aber ihre molekulare Grundlage bleibt weitgehend unbekannt. Da die pathophysiologische Rolle von zerebralen Pericyten bei neurologischen Erkrankungen faszinierend und von großer Bedeutung ist, sind die In-vitro-Modelle nicht nur ausreichend geeignet, sondern auch in der Lage, verschiedene Techniken für diese Studien zu integrieren. Mehrere Methoden wurden als In-vitro-Modelle für die Extraktion von zerebralen Pericyten vorgeschlagen, obwohl ein antibiotikafreies Protokoll mit hoher Leistung wünschenswert ist. Am wichtigsten ist, dass eine Methode, die die Leistung pro Extraktion erhöht hat, den Einsatz von mehr Tieren reduziert.
Hier schlagen wir eine einfache und effiziente Methode zur Extraktion von zerebralen Pericyten mit ausreichend hoher Leistung vor. Das Maushirngewebe wird mit einer BSA-Dextran-Lösung zur Trennung von Gewebeablagerungen und mikrovaskulärem Pellet gemischt. Wir schlagen eine dreistufige Trennung mit anschließender Filtration vor, um ein mikrogefäßreiches Filtrat zu erhalten. Bei dieser Methode reicht die Menge der mikrovaskulären Fragmente, die von 10 Mäusen gewonnen wurden, aus, um 9 Brunnen (je 9,6 cm2) einer 6-Well-Platte auszusäen. Am interessantesten ist, dass der Benutzer mit diesem Protokoll 27 pericyte reiche Brunnen (je 9,6 cm2) in Durchgang 2 erhalten kann. Die Reinheit der Pericytkulturen wird durch den Ausdruck klassischer Pericytmarker bestätigt: NG2, PDGFR-B und CD146. Diese Methode zeigt ein effizientes und praktikables In-vitro-Tool für physiologische und pathophysiologische Studien an Pericyten.
Zerebrale Pericyten sind ein wesentlicher Bestandteil der neurovaskulären Einheit (NVU), die eine funktionelle Einheit mit den zerebralen Endothelzellen der Bluthirnschranke (BBB), Gliazellen, extrazellulären Matrix und Neuronen umfasst. Pericyte sind ein wichtiger Bestandteil der regulierten Funktion des Zentralnervensystems (ZNS), da sie als eine der Schnittstellen für den Austausch molekularer und zellulärer Informationen dienen.
Zerebrale Pericyten sind in die abluminale Seite der Hirnmikrogefäße eingebettet und sind für die Etablierung von1 und die Aufrechterhaltungvon 2 der BBB-Physiologie unerlässlich. Mehrere neuere Arbeiten haben auch die Rolle der zerebralen Pericyten in der Angiogenese3 und Gefäßreifung4,Endothelial Morphogenese5 und Überleben6, und bei der Kontrolle des Cholesterinstoffwechsels des Gehirns7hervorgehoben. Wichtig ist, dass die Dysregulation in einem dieser Prozesse ätiologische Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen sind.
In der Tat sind Pericyte eine funktionelle Notwendigkeit für die normale BBB-Funktion und ihren Schutz gegen das Fortschreiten mehrerer neurologischer Erkrankungen. Degenerierende Physiologie und Verlust von Pericyten sind häufige Nenner im Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit8, neuronaler Verlust während der Weißen Materie Dysfunktion9, Multiple Sklerose10, septische Enzephalopathie11, akute Phase ischämischen Schlaganfall12 und bei anderen neurologischen Erkrankungen. Perizyten sind auch bei der Tumormetastasierung13hilfreich. Interessanterweise haben Pericyte auch gezeigt, dass eine rettende Rolle nach neurologischen Trauma und Störungen zeigen: bei der Remyelination im Gehirn1,ischämischer Schlaganfall, Rückenmarksverletzung14 und Förderung der Angiogenese15. Die Anfälligkeit von Pericyten, um die pathophysiologische Manifestation neurologischer Traumata und Störungen zu verstärken, macht sie zu einem potenziellen therapeutischen Ziel16.
In-vitro-Forschungsmodelle von Pericyten im BBB sind wichtige Instrumente, um umfangreiche Studien durchzuführen. Diese Modelle bieten eine Plattform für ausgefeiltere Studien, indem sie Arbeitsmodelle der BBB und mehr darstellen. Zum Beispiel können diese Modelle verwendet werden, um die zelluläre Physiologie innerhalb von Pericyten und unter anderen Zelltypen der NVU zu verstehen. Auch In-vitro-Modelle sind aus erster Hand Untersuchungswerkzeuge, um den pharmakologischen Einfluss neuer Medikamente und Moleküle auf Pericyten zu testen. Diese Modelle können auch verwendet werden, um die pathophysiologische Rolle von Pericyten in Bezug auf neurologische Störungen zu verstehen. Dennoch erfordert die Entwicklung von In-vitro-Modellen eine höhere Produktion, um experimentelle Freiheit zu ermöglichen. Diese Modelle sollten einfach und schnell sein und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere reduzieren. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, solche Modelle zu einem Doppel- und Dreizellkulturmodell zu entwickeln, wünschenswert.
Es gibt viele Protokolle, die entwickelt wurden. Die Protokolle, die von Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, und Crouch und Doetsch21 vorgeschlagen wurden, sind lobenswerte Ansätze, die die meisten Notwendigkeiten befriedigen. Alle diese Methoden liefern effektive Ergebnisse, aber die Abhängigkeit von einer großen Anzahl von Versuchstieren bleibt ein gemeinsamer Nenner für diese Protokolle. Daher wird es obligatorisch, eine High-Output-Methode zu entwickeln, die Pericyten mit maximaler Effizienz isolieren und reinigen kann. In diesem Protokoll wird die Reinheit der Zellen, die nach einer zweiten Passage erhalten wurden, mit mehreren Pericytes-Markern überprüft. Wir überprüften auf Platelet-Derived Growth Factor Receptor–A (PDGFR-, das als klassischer Marker der Pericyte17verwendet wird, und auf NG2 (neuron-glial Antigen 2), das ein Marker für pericyte vermittelte Vaskuläre Morphogenese22 und Vaskularisation23ist. Wir überprüften auch auf Differenzierungscluster 146 (CD 146), der als eines der Moleküle berichtet wurde, die in den Pericyten17,18exprimiert wurden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von primären Pericyten von Mäusen (Wildtyp oder Transgenen) vor, das alle oben genannten Anforderungen mit hoher Leistung erfüllt. Wir verwenden eine antibiotika- und immunpanning freie Selektionsmethode der Proliferation für die primären zerebralen Pericyten, die sich als effizientes Modell für die Durchführung von In-vitro-Studien erweisen wird.
Zerebrale Pericyten sind integraler Bestandteil der NVU und spielen eine aktive Rolle bei der Induktion und Wartung der BBB24. Ebenso ist die Rolle dieser Zellen bei den verschiedenen neurodegenerativen Störungen und Gefäßpathologien faszinierend. Daher wird ein effizientes primäres Pericytzellmodell mit hoher Leistung eine effiziente Plattform für In-vitro-Studien bieten.
Es gibt verschiedene Protokolle, die für die Isolierung von primären Pericyten vorgeschlagen wurden (Abbildung 4). Tigges et al.17 schlugen eine Methode vor, die kortikale Gewebe mit Hirnhäuschen. Dieser Ansatz ist die Zartisierung von Gewebe von 6 Mäusen (eine 37 °C, 70 min Verdauung mit Papain/DNase-Enzymen), gefolgt von einem Zerfallsschritt über 21 G- und 18 G-Nadeln. Dieses Protokoll schlägt eine einstufige Trennung (Zentrifugation in 22% BSA/PBS-Lösung) vor, die mindestens 2 Kollagen-I-beschichtete Brunnen einer 6-Well-Platte ergibt. Die Zellen werden in endothelialeZellwachstumsmedium (ECGM) bis Durchgang 3 und später in Pericyt Growth Medium (PGM) für Passaging-Zellen gehalten, um die Pericyt-Proliferation zu fördern. In einem anderen ähnlichen Ansatz schlugen Chen et al.18 eine Gewebedissoziation vor, indem sie das Gewebe mit einer sterilisierten Rasierklinge und Gewebeverdauung mit Kollagenase/DNase für 90 min bei 37 °C würfelten. Nach einer einstufigen Trennung (Zentrifugation in 22% BSA) der Zellen wird die Myelinschicht entfernt und das Pellet zweimal in ECGM gewaschen. Die Mikrogefäße sind in 3 Brunnen eines Kollagens plattiert, das ich 6-Well-Platten beschichtet habe. Nach dem Erreichen des Zusammenflusses werden die Zellen zweimal durchdrungen und später in PGM aufrechterhalten. Am Ende, wenn Zellen im Verhältnis 3 übergeben werden, können wir 27 Brunnen von 6-Well-Platten nur bei der Verwendung von 10 Mäusen am Anfang des Protokolls erhalten.
In Thomsen et al. schlagen die Autoren die Isolierung von zerebralen Pericyten über eine zweistufige Enzymverdauungvor 19. Meninges und weiße Materie werden entfernt, und Gehirnproben werden in kleine Stücke geschnitten. Die Gewebestücke durchlaufen die erste Enzymreaktion in Kollagenase/DNase I für 75 min bei 37 °C, nach einem Trennschritt in 20% BSA. Das Pellet wird in Kollagennase/Dispase/DNase I 50 min bei 37 °C gesammelt und weiter verdaut. Diesem Schritt folgt die Mikrogefäßtrennung in einem Percoll-Gradienten von 33 % und wird einmal weiter gewaschen. Die Mikrogefäße werden auf Kollagen IV/Fibronectin beschichteten 35 mm Schalen gesät. Die Proliferation von Pericyten wird von 10% FCS und Gentamicinsulfat in DMEM für 10 Tage begünstigt. In einem weiteren zweistufigen Enzymverdauungsansatz schlagen Yamazaki et al. vor, das ausgeschnittene Gewebe in kalten DMEM20zu schneiden. In der ersten Enzymreaktion werden Proben 75 min bei 37 °C mit Kollagenase/DNase I behandelt. Nach einem Schritt Zentrifugation wird das Pellet erneut einmal gewaschen und eine zweite Enzymreaktion in Kollagenase/Dispase für 60 min bei 37 °C eingeleitet. Nach einer einstufigen Trennung wird das Pellet in 22% BSA-Lösung resuspendiert und zentrifugiert. Schließlich wird das mikrovaskuläre Pellet resuspendiert und in eine 6-Well-Platte eintellert. Für 5 Mausgehirne kann 1 Brunnen einer 6-Well-Platte plattiert werden. Um die Pericyten zu erhalten, werden Endothelkulturen dreimal durchgelassen, während sie in der Maus Gehirn Endothelzelle (mBEC) Medium II beibehalten werden. Crouch und Doetsch20 suggerieren Pericyt-Reinigungsmethode durch FACS. Gewebeproben aus der Kortex- und ventrikulären subventrikulären Zone des Maushirns werden mit einem Skalpell mikroseziert und gründlich gehackt. Nach Kollagenase/Dispase-Enzym-Inkubation für 30 min bei 37 °C wird das verdaute Gewebe von Myelin getrennt und Trümmer in einer 22%v/v Percoll-Lösung zentrifugiert. Die Zellsuspension wird dann in fluoreszierend konjugierten Antikörpern für die FACS-Analyse und -Sortierung inkubiert. Die sortierten Zellen sind in kollagenbeschichteten Brunnen von 24 Brunnenplatten plattiert. Es wird vermutet, dass ein Kortex genügend Zellen für eine Beschichtung in einem Brunnen von 24-Well-Platte ergibt.
Selbst wenn sie produktiv sind, haben diese Methoden mehrere Einschränkungen, von der Verwendung einer hohen Anzahl von Tieren für die Isolierung von Einzelchargen bis hin zu einer sehr begrenzten Produktionsmenge.
Bei der Entwicklung dieses vorgeschlagenen Protokolls gelang es uns, eine hohe Leistung zu erzielen: 9 Brunnen einer 6-Well-Platte von nur 10 Mäusen. Zu diesem Zweck, Entfernung von Meningen sorgt für die einstufige Entfernung von großen Gefäßen aus dem Gewebe. Der Dounce Gewebeschleifer ist besser geeignet für Weichteile wie das Gehirn. Es sorgt auch für Probenreduktion mit dem lockeren Stößel, Homogenisierung mit dem engen Stößel und verhindert unnötige Zellschäden. Eines der Hauptziele in primären Zellkulturprotokollen ist die minimale Verschwendung von Gewebe und die erweiterte Rückgewinnung der zerebralen Vaskulatur. Im vorgelegten Protokoll wird dies durch repetitive Zentrifugation des dextran-BSA infundierten Gewebehomogenats erreicht. Ein dreistufiger Zentrifugationsansatz hilft, große Mengen Vaskulatur aus dem Gewebehomogenat zurückzugewinnen. Dies ermöglicht eine 3x verbesserte Rückgewinnung von Mikrogefäßen. Nach der Trennung ist die Filtration der nächste wichtige Schritt, der den Ausschluss von glatten Muskelzellen assoziierten großen Gefäßen begünstigt. Wie bereits erwähnt, wurde eine Kombination verschiedener Enzyme für die enzymatische Verdauung vorgeschlagen. Während DNase und Kollagennase/Dispase verwendet werden, um Zellklumpen zu reduzieren bzw. Einzelzellen zu isolieren, ist es sehr wichtig, den Zelltod in einer solchen invasiven Umgebung zu verhindern und dies wird durch TLCK verhindert, was die Endausbeute erhöht. Zunächst darf im ersten Durchgang eine endotheliale Monolayer wachsen, die später das Wachstum von befestigten Pericyten auf dem Einlayer unterstützt. Da das Überleben der primären Endothelzellen bei der Passierung reduziert wird, erhöht es die Wahrscheinlichkeit für Pericyten-Retrieval. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll eine weitere Passage, die die Vermeidung von Endothelzellkontamination sicherstellt. Es sollte beachtet werden, dass bei einer höheren Anzahl von Zellen aus P2 die Abhängigkeit von weiteren Passaging der Zellen reduziert wird. Darüber hinaus reduziert es die Möglichkeit des Perizytenwachstums, das von glatten Muskelzellen überholt wird, die sich bei viel höherer Rate vermehren.
Um eine höhere Leistung zu erreichen, gibt es mehrere Schritte, die kritisch sind und in Bezug auf Temperatur und Zeit genau ausgeführt werden sollten. Die Vermischung von Gewebehomogenat in BSA-Dextran sollte schnell erfolgen. Die Pelletdissoziation nach den Zentrifugationsschritten sollte schnell sein, um den Zelltod zu verhindern. Darüber hinaus sollten 33 min enzymatische Verdauung mit Präzision und Sorgfalt durchgeführt werden. Eine der Einschränkungen für dieses Protokoll ist die 7-8-Tage-Dauer, die endotheliale Einlayer wachsen und das Wachstum von Pericyten weiter erleichtern darf. Offensichtlich ist die Isolierung von Mikrogefäßen btter, das Wachstum der Einlayer ist schneller, und daher gibt es eine erhöhte Anzahl von Pericyten. Es wird empfohlen, nicht weniger als 10 Mäuse in jeder Extraktion zu verwenden, um eine ausreichende Anzahl von mikrovaskulären Fraktionen zu gewährleisten, um das Perizytenwachstum weiter zu unterstützen. Wenn die oben genannten Punkte sorgfältig befolgt werden, kann die gewünschte Zelldichte für zerebrale Pericytenkultur leicht erreicht werden.
In-vitro-Modelle bieten eine praktikable Plattform für die Entwicklung von Derivatemodellen, um mehr Informationen über die pathophysiologische Relevanz und Kommunikation zwischen den anderen Zellen der NVU bei neurologischen Störungen zu erhalten. Isolierte Pericyten können in eine bizelluläre Kultur (mit endotheliale oder gliale Zellen) und trizelluläre Kultur (Endothel- und Gliazellen) eingearbeitet werden. Die Entwicklung dieser Modelle wurde hier nicht diskutiert. Abschließend möchte ich sagen, dass dieses Protokoll einen Ansatz für die Isolierung von Primärzellen mit höherer Leistung und eine bessere Plattform für die In-vitro-Forschung im Zusammenhang mit der zerebralen Pericytbiologie bietet.
The authors have nothing to disclose.
LT und FG wurden von Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) im Rahmen des Gemeinsamen EU-Programms – Neurodegenerative Disease Research (JPND) für das Projekt SNOWBALL gewährt.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |