Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Sebrafisken (Danio rerio) har dukket opp som en kraftig modell for studiet av biologiske prosesser av flere grunner, inkludert kort generasjonstid, rask utvikling og amenabilitet til genetiske teknikker. Som et resultat brukes sebrafisk ofte i høye gjennomstrømning små molekylskjermer for toksikologisk forskning og narkotikaoppdagelse. Sebrafisk er også en attraktiv modell for studiet av utviklingsprosesser gitt at en enkelt kvinne rutinemessig kan produsere 50-300 egg om gangen, og de optisk klare embryoene utvikler seg eksternt slik at det kan foreffektiv visualisering av utviklingsprosesser. Tidlig forskning var imidlertid hovedsakelig avhengig av fremover genetiske skjermer ved hjelp av N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagens på grunn av utfordringer i å etablere omvendt genetiske teknikker. For omtrent to tiår siden ble morfonoer først brukt i sebrafisk til å slå ned målrettede gener¹. Morpholinos er små antisense oligonucleotides som hemmer oversettelse av mål mRNA etter mikroinjeksjon i et embryo på et tidlig utviklingsstadium. En stor svakhet i morfonoer er at de fortynnes når cellene deler seg og mister generelt effektiviteten med 72 timer etter befruktning (hpf). Mens morfonoer forblir et kraftig verktøy for sebrafisk genforstyrrelser, transkripsjon aktivator-lignende effektor nucleases (TALENs), sink-finger nucleases (ZFNer), og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPRs) blir nylig brukt til å direkte målrette sebrafisk genom^2,3. Disse omvendte genetiske strategiene, i kombinasjon med fremover genetikk og høye gjennomstrømningsskjermer, har etablert sebrafisken som en kraftig modell for å studere genuttrykk og funksjon.

Evnen til å studere genfunksjon krever generelt en evaluering av spatio-temporal fordeling av gen- eller genproduktuttrykk. De to mest brukte teknikkene for å visualisere slike uttrykksmønstre under tidlig utvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunohistochemistry (IHC). In situ hybridisering ble først utviklet i 1969 og er avhengig av bruk av merkede antisense RNA-sonder for å oppdage mRNA-uttrykk i en organisme⁴. I motsetning brukes merkede antistoffer i immunhistokjemi for å visualisere proteinuttrykk. Ideen om merking proteiner for deteksjon dateres tilbake til 1930⁵ og det første IHC eksperimentet ble publisert i 1941 da FITC-merkede antistoffer ble brukt til å oppdage patogene bakterier i infiserte vev⁶. ISH og IHC har utviklet seg og forbedret seg betydelig i løpet av de påfølgende tiårene, og brukes nå begge rutinemessig i molekylær- og diagnostisk forskningslaboratorium^7,8,9,10,11. Mens begge teknikkene har fordeler og ulemper, tilbyr IHC flere fordeler over ISH. Praktisk talt er IHC mye mindre tidkrevende enn ISH og er generelt billigere avhengig av kostnaden for det primære antistoffet. I tillegg er mRNA-uttrykk ikke alltid en pålitelig beregning av proteinuttrykk som det har blitt demonstrert hos mus og mennesker at bare omtrent en tredjedel av proteinoverflodsvariasjonen kan forklares av mRNA overflod¹². Av denne grunn er IHC et viktig supplement for å bekrefte ISH-data, når det er mulig. Til slutt kan IHC gi subcellulære og samlokaliseringsdata som ikke kan bestemmes av ISH^13,14,15. Her beskriver vi en trinnvis metode for å på en pålitelig måte oppdage proteiner ved immunhistokjemi i hele mount sebrafiskembryoer og larver. Målet med denne teknikken er å bestemme det romlige og timelige uttrykket av et protein av interesse for hele embryoet. Denne teknologien benytter antigenspesifikke primære antistoffer og fluorescerende merket sekundære antistoffer. Protokollen er lett tilpasningsdyktig til bruk på lysbildemonterte vevseksjoner og for bruk med kromogene substrater i stedet for fluorescens. Ved hjelp av denne protokollen viser vi at utvikling av sebrafisk skjelettmuskulatur uttrykker ionotropiske glutamatreseptorer, i tillegg til acetylkolinreseptorer. NMDA-type glutamat reseptor underenheter er påviselig på langsgående muskelved 23 hpf.