Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.
Abstract
Die Vaskuläre Entwicklung wird durch die sequentielle Expression spezifischer Gene bestimmt, die durch In-situ-Hybridisierungstests bei Zebrafischen in verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht werden können. Um die Rolle von Endoglin(eng) bei der Gefäßbildung während der Entwicklung einer erblichen hämorrhagischen Telangangiektasien (HHT) zu untersuchen, werden Morpholino-vermittelte gezielte Knockdown von eng in Zebrafischen verwendet, um seine zeitliche Expression und die damit verbundenen Funktionen zu untersuchen. Hier wird die Voll-In-situ-RNA-Hybridisierung (WISH) für die Analyse von eng und seinen nachgelagerten Genen in Zebrafischembryonen eingesetzt. Außerdem werden Rohrbildungstests in HHT-Patienten-abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-differenzierten Endothelzellen eng (iPSC-ECs; mit eng-Mutationen) durchgeführt. Ein spezifisches Signalverstärkungssystem mit der gesamten In-Situ-Hybridisierung – WISH bietet eine höhere Auflösung und niedrigere Hintergrundergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Um ein besseres Signal zu erhalten, wird die Nachfixierungszeit nach der Sondenhybridisierung auf 30 min eingestellt. Da Fluoreszenzfärbung bei Zebrafischembryonen nicht empfindlich ist, wird sie hier durch Diaminobelidin (DAB) ersetzt. In diesem Protokoll werden von HHT-Patienten abgeleitete iPSC-Linien, die eine eng-Mutation enthalten, in Endothelzellen differenziert. Nach der Beschichtung einer Platte mit Kellermembranmatrix für 30 min bei 37 °C werden iPSC-ECs als Monolayer in Brunnen ausgesät und 3 h bei 37 °C gehalten. Anschließend werden die Rohrlänge und die Anzahl der Zweige anhand mikroskopischer Bilder berechnet. So wird mit diesem verbesserten WISH-Protokoll gezeigt, dass eine reduzierte Eng-Expression die Endothel-Vorläuferbildung bei Zebrafischembryonen beeinflusst. Dies wird durch Rohrbildungstests mit iPSC-ECs bestätigt, die von einem Patienten mit HHT abgeleitet wurden. Diese Assays bestätigen die Rolle für eng in der frühen Gefäßentwicklung.
Introduction
Eine einzige Mutation auf eng (CD105) wurde bei Patienten mit HHT berichtet. Die Mutation führt zu einer erhöhten PROLIFERATION der EG und einer reduzierten durchflussvermittelten EG-Dehnung1,2. Es wurde auch bereits berichtet, dass ENG-Mangel reduziert endotheliale Marker Expression (d.h. kdrl, cdh5, hey2) in Zebrafisch3. Endoglin, das hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert wird, ist ein Transmembran-Glykoprotein und fungiert als Co-Rezeptor zur Transformation des Wachstumsfaktors (TGF-) Familienmitglieder. Es weist die BMP9-Bindung auf die Zelloberfläche an, um das nachgeschaltete Gen, einschließlich der Id1-Expression, zu regulieren, um eine Stammzelldifferenzierung in Richtung ECs4zu induzieren. Somit spielt das eng-Gen eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese und der menschlichen Gefäßerkrankung5,6. Wir haben zuvor die Auswirkungen von Endoglin-Knockdown auf die Gefäßbildung in Zebrafischembryonen untersucht, gefolgt von einer Analyse von iPSCs-abgeleiteten ECs, die von einem HHT-Patienten mit einer eng-Mutation 7erworben wurden. Dieses Protokoll zeigt die Auswirkungen des ENG-Mangels auf die endotheliale Vorläufermarkerexpression und Rohrbildung, eine quantifizierbare Methode zur Messung der In-vitro-Angiogenese.
Um die räumliche und zeitliche Expression zu untersuchen, wird WISH verwendet, um die Genexpression in vivo8zu detektieren. In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Methode zur Verwendung von markierten Sonden mit Komplementsequenzen von Zielnukleinsäuren (DNA oder mRNA), um Zielnukleinsäurehybriden in einer festen Probe zu erkennen und zu visualisieren. Der Prozess verstärkt Genexpressionssignale in vivo und wird verwendet, um die Expression von Genen durch Mikroskopie zu erkennen. WISH wurde häufig in verschiedenen Modelltieren verwendet, vor allem in Zebrafischen9. Es wird auch verwendet, um die folgenden Daten zu erfassen: 1) Gen räumliche /zeitliche Expressionsmuster, die Informationen über Genfunktion und Klassifizierung liefern; und 2) speziell exprimierte Genmarker, die in Hochdurchsatzmedikamenten oder Mutanten-Screening10verwendet werden.
Chromogene Sonden lassen sich mit der traditionellen Chromosomen-In-situ-Hybridisierung (CISH) leicht abbauen, was zu hohem Hintergrundrauschen und unspezifischen Signalen11,12führt. Die WISH-Methode verwendet zwei unabhängige Doppel-Z-Sonden, die entwickelt wurden, um RNA-Sequenzen auf das Ziel auszutosen. Jede Sonde enthält eine 18-25-Sequenz, die die Ziel-RNA ergänzt, und eine 14 Base-Tail-Sequenz (konzeptioniert als Z). Die Zielsonden werden in einem Paar (doppel Z) verwendet. Die beiden Hecksequenzen bilden zusammen eine 28 Basishybridisierungsstelle für den Vorverstärker, die 20 Bindungsstellen für den Verstärker enthält. Der Verstärker wiederum enthält 20 Bindungsstellen für die Etikettensonde und kann theoretisch bis zu 8.000 Etiketten für jede Ziel-RNA-Sequenz ergeben.
Diese fortschrittliche Technologie ermöglicht die gleichzeitige Signalverstärkung und Hintergrundunterdrückung, um eine Einzelmolekül-Visualisierung zu erreichen und gleichzeitig die Gewebemorphologie zu erhalten13. Weitere Modifikationen der WISH-Methoden basieren auf früheren Forschungsarbeiten14, einschließlich zusätzlicher Fixierung und DAB-Färbung. Vorausgesetzt, hier ist ein verbessertes WISH-Protokoll, das auch dann funktionieren kann, wenn die Ziel-RNA teilweise verkleinert oder abgebaut wird. Zu den Vorteilen gehört, dass es in 24 h ohne RNase-freie Bedingungen abgeschlossen werden kann. Signale können auch gleichzeitig über mehrere Kanäle von mehreren Zielen erkannt werden, und die Ergebnisse sind konsistent und kompatibel mit Ergebnissen von verschiedenen Automatisierungsplattformen mit hohem Durchsatz.
Die Ergebnisse von Tiermodellen spiegeln nicht das gleiche Phänomen wider, das beim Menschen auftritt. ENG enthält zwei Paare konservierter Cysteins, C30-C207 und C53-C182, die Disulfidbrücken in verwaisten Regionen bilden. Um die Rolle von eng bei HHT-Patienten weiter zu untersuchen, wurden Tube-Formations-Assays mit iPSCs, die von HHT-Patienten abgeleitet wurden, in Zellen ohne/mit eng-Mutationen (Cys30Arg, C30R)15durchgeführt. Nachdem Kubota et al. zuerst über das Rohrbildungsexperiment16berichtet haben, wurde der Assay auf verschiedene Weise entwickelt. Es wurde verwendet, um angiogene oder antiangiogene Faktoren zu identifizieren, die Signalwege in der Angiogenese zu definieren und Gene zu identifizieren, die die Angiogenese regulieren17.
Vor der Verfügbarkeit von patientenabgeleiteten iPSC-ECs verwendeten die Forscher hauptsächlich kultivierte ECs, um Angiogense16zu untersuchen. Für Endothelzellen ist es jedoch eine technische Herausforderung, exogene Gene mit einem Virus zu transduzieren, da die Durchreisezahl der ECs begrenzt ist. Dies liegt daran, dass es kaum genug zelluläres Material gibt, um von menschlichen Gefäßen entweder aus der Operation oder von den zugelassenen Spendern gesammelt zu werden. Mit der Erfindung der iPSC-Generierungstechnik von Shinya Yamanaka können aus iPSCs abgeleitete humane ECs zuverlässig in In-vitro-Experimenten eingesetzt werden, wie zuvorberichtet 18.
Die Verwendung viral transduzierter ECs mit begrenzten Anzahln und Passagen kann für Signalstudien ausreichen, aber für funktionelle Studien ist es besser, mutierte pluripotente Stammzelllinien (entweder iPSCs oder CRISPER/Cas9-gezielte hESCs) zu erzeugen und sie dann in ECs für Angiogenesestudien zu differenzieren, die Röhrenbildungstestsverwenden 19. Die Rohrbildung kann verwendet werden, um die Funktion von Endothelzellen zu bewerten, die Mutationen tragen. Dieses Protokoll beschreibt auch die Rohrbildung auf einer Angiogeneseplatte, die eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Methode ist.
Das nachstehende Protokoll bietet eine zuverlässige und systemische Methode zur Untersuchung der Rolle bestimmter Gene bei der Gefäßbildung, zusammen mit Details für in vivo-Expressionsmuster und In-vitro-Funktionalquantifizierung zur Modellierung menschlicher Krankheiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wendete eine verbesserte In-situ-RNA-Analyseplattform für Zebrafisch- und Röhrenbildungstests auf iPSC-ECs an, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden. Die traditionelle ISH-Methode erfordert einen längeren Experimentellen Zyklus mit zusätzlichen experimentellen Schritten. Das Protokoll hat einige wichtige Verbesserungen, die Verwendung von unabhängigen Doppel-Z-Sonden und iPSCs von einem Patienten mit HHT abgeleitet, die in WISH-Assays bzw. Rohrbildung angewendet wurden. Diese Verfeinerungen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]] unterstützt; der CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [Fördernummer 2016-I2M-4-003 (an Jun Yang)]; der PUMC Youth Found und die Fundamental Research Funds for the Central Universities [Grant Nummer 2017310013 (to Fang Zhou)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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