التقاط استجابة إصابات القلب من مجموعات الخلايا المستهدفة عن طريق مسح القلب التصوير ثلاثي الأبعاد

منذ فترة طويلة يعتبر القلب أن يكون جهاز ما بعد mitotic، ولكن الأدلة الأخيرة تثبت أن تجديد عضلة القلب يحدث في قلب الإنسان الكبار في حوالي 1٪ في السنة¹. ومع ذلك، هذه المعدلات المنخفضة من دوران عضلة القلب غير كافية لتجديد فقدان هائلة من الأنسجة التي تحدث بعد الإصابة. القلب الذي عانى من احتشاء عضلة القلب سوف تفقد حوالي مليار عضلة القلب، وغالبا ما تكون بمثابة مقدمة لفشل القلب والموت القلبي المفاجئ^2،3. مع أكثر من 26 مليون شخص يعانون من قصور القلب في جميع أنحاء العالم، هناك حاجة غير ملباة للعلاجات التي يمكن أن تعكس الأضرار الناجمة عن أمراض القلب⁴.

من أجل سد هذه الفجوة في العلاجات، بدأ العلماء التحقيق في الآليات المحفوظة تطوريا التي تكمن وراء التجديد الذاتي ة بعد الإصابة. نموذج واحد لدراسة تجديد القلب الثدييات هو الفأر الوليدي. في غضون الأسبوع التالي للولادة ، تتمتع الفئران الوليدية باستجابة تجديدية قوية بعد تلف القلب^5. لقد أثبتنا سابقا أن الفئران حديثي الولادة يمكن تجديد قلوبهم عن طريق انتشار عضلة القلب بعد استئصال apical⁵. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تثير تجديد القلب في الولدان، فإن الجراحة تفتقر إلى الصلة السريرية لإصابات القلب البشرية. من أجل تقليد إصابة بشرية في نموذج الفأر الوليدي ، قمنا بتطوير تقنية للحث على احتشاء عضلة القلب من خلال انسداد الشريان التاجي^6. تتطلب هذه التقنية الربط الجراحي للشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) ، وهو مسؤول عن توصيل 40٪ -50٪ من الدم إلى عضلة القلب البطينية اليسرى^6،7. وبالتالي ، فإن الجراحة تؤدي إلى احتشاء يؤثر على جزء كبير من جدار البطين الأيسر. هذا الضرر الذي يلحق بعضلة القلب سيحفز انتشار عضلة القلب وتجديد القلب في الولدان⁵.

توفر جراحة انسداد الشريان التاجي طريقة مترجمة وقابلة للاستنساخ بشكل كبير للكشف عن الأعمال الداخلية لتجديد القلب. ويوازي جراحة حديثي الولادة تصلب الشرايين التاجية في قلب الإنسان، حيث تراكم البلاك داخل الجدران الداخلية للشرايين يمكن أن يسبب انسداد واحتشاء عضلة القلب اللاحقة^8. بسبب الفراغ في العلاجات العلاجية لمرضى قصور القلب ، يرتبط الانسداد في LAD بمعدلات الوفيات التي تصل إلى 26٪ في غضون عام بعد الإصابة⁹، وبالتالي تم تسميته “صانع الأرملة”. تتطلب التطورات في العلاجات نموذجًا يعكس بدقة الآثار الفسيولوجية والمرضية المعقدة لإصابة القلب. يوفر البروتوكول الجراحي لإصابة قلب الفأر الوليدية منصة تسمح للباحثين بالتحقيق في الإشارات الجزيئية والخلوية التي تشير إلى تجديد قلب الثدييات بعد الإصابة.

يسلط البحث الأخير الضوء على العلاقة الديناميكية بين البيئة خارج الخلية وخلايا القلب المنتشرة. على سبيل المثال ، يمكن تمديد نافذة التجدد بعد الولادة عن طريق تقليل صلابة المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالقلب^10. المواد الحيوية من مصفوفة خارج الخلية الوليدية يمكن أيضا تعزيز تجديد القلب في قلوب الثدييات البالغة بعد إصابة القلب^11. كما يرافق انتشار عضلة القلب هو استجابة أنجيوجينيك^12،13؛ وقد تبين أن تكوين الشريان الجانبي الفريد من نوعه لقلب الفأر الوليدي التجدد ضروري لتحفيز تجديد القلب^12. وعلاوة على ذلك، أثبت مختبرنا أن الإشارات العصبية تنظم انتشار عضلة القلب وتجديد القلب عن طريق تعديل مستويات عامل النمو، فضلا عن الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة¹⁴. هذه النتائج تؤكد على الحاجة إلى تتبع مجموعات الخلايا غير myocyte استجابة لإصابات القلب. من أجل تحقيق هذا الهدف، استفدنا من نظام إعادة تركيب Cre-lox في خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدمج التعبير التأسيسي أو المشروط لبروتينات مراسل الفلورسنت لتتبع النسب. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام أساليب متقدمة لتحديد نمط التوسع clonal مع خط الماوس قوس قزح، الذي يعتمد على التعبير العشوائي من المراسلين الفلورسنت تعتمد على Cre، متعددة الألوان لتحديد التوسع clonal من مجموعات الخلايا المستهدفة¹⁵. توظيف تتبع النسب مع جراحة انسداد الشريان التاجي الوليدي هو أداة قوية لتشريح الآليات الخلوية المعقدة لتجديد القلب.

من الصعب تتبع نسب الخلايا المسماة بالفلورسنت مع تصوير الأعضاء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام تقنية الإخراج وإعادة البناء التقليدية – خاصة عندما تكون مجموعات الخلايا هشة ، مثل الألياف العصبية أو الأوعية الدموية. في حين أن التصوير المباشر الكامل للجهاز عن طريق الإخراج البصري يمكن التقاط مجموعات الخلايا السطحية ، فإن الهياكل التي توجد في عمق الأنسجة لا تزال غير قابلة للوصول. للتحايل على هذه الحواجز ، تم تطوير تقنيات إزالة الأنسجة للحد من غموض أنسجة الأعضاء بأكملها. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في مسح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة الأنسجة المتوافقة hYdrogel (وضوح) – الأساليب القائمة ، والتي واضحة الأنسجة الثابتة عن طريق استخراج الدهون¹⁶. كما يتم اتخاذ خطوات لتجانس مؤشر الانكسار وتقليل بعد ذلك تشتت الضوء أثناء التصوير^17. واحدة من هذه الطريقة هي الوضوح النشط ، مما يسرع تحلل الدهون باستخدام الكهربية لاختراق المنظفات في جميع أنحاء الأنسجة^18. على الرغم من فعالية، وهذا الأسلوب تطهير الأنسجة يتطلب معدات باهظة الثمن ويمكن أن يسبب تلف الأنسجة، مما يجعل النهج غير متوافق مع مجموعات الخلايا الهشة مثل الأعصاب القلبية¹⁹. وهكذا ، فإننا نستخدم نهج الوضوح السلبي ، الذي يعتمد على الحرارة لتسهيل اختراق المنظفات بلطف ، وبالتالي المساعدة في الاحتفاظ بهياكل الخلايا المعقدة^20،21.

ويعتقد عادة الوضوح السلبي لتكون أقل كفاءة من الوضوح النشط¹⁸، كما يرافق هذه التقنية في كثير من الأحيان من قبل اثنين من العقبات الرئيسية : عدم القدرة على مسح عمق الجهاز بأكمله وكمية طويلة من الوقت اللازم لمسح أنسجة الكبار. يتغلب نهج الوضوح السلبي لدينا على كل من هذه الحواجز من خلال عملية تطهير سريعة قادرة على إزالة أنسجة القلب الوليدية والبالغين بشكل كامل. وقد وصلت تقنية إزالة الأنسجة السلبية CLARITY لدينا إلى الكفاءة التي تسمح بتصور مجموعة متنوعة من مجموعات خلايا القلب ، بما في ذلك مجموعات نادرة موزعة في جميع أنحاء قلب البالغين. عندما يتم تصوير القلب مسح مع المجهر المعالبؤر، يمكن إضاءة الهندسة المعمارية للنقش الخلايا محددة أثناء التنمية، والمرض، والتجدد.