Recapituleren van de overgang van de suckling-to-Spening in vitro met foetale intestinale Organoïden

Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren die zijn opgericht door het Ethic Committee for dier experimenten van de Universiteit van Amsterdam in volledige overeenstemming met de nationale wetgeving inzake dierlijk onderzoek volgens de Europese richtlijn 2010/63/EU voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (ALC312). 1. isolatie van foetale kleine intestinale organoïden Offeren de E18-E20 foetussen door onthoofding met chirurgische schaar, volgens de goedgekeurde ethische voorschriften. Onmiddellijk na euthanasie, voorzichtig te snijden Open de onderbuik van de foetus met intestinale schaar en verwijder de hele darm.Opmerking: isolatie moet worden uitgevoerd met darmen tussen E18 en E20 van de dracht om de juiste overgang en rijping van de speen tot het spenen in vitro te bereiken. Met twee kleine Tang, strek de darm. Gebruik de maag en de appendix als geleidingen, snijd het proximale en distale deel van de dunne darm uit elkaar.Opmerking: als dissectie zorgvuldig is gedaan, is het mogelijk om de Colon ook te isoleren. Snijd het uit elkaar met behulp van aanhangsel als leidraad (Figuur 1). Maak de darm longitudinaal open: Bevestig de darm met behulp van een scheermesje in de lengte geplaatst en trek de darm door te schuiven Tang (een arm van de Tang aan elke kant van het scheermesje) langs het scheermesje. Snijd vervolgens de geopende darm in stukjes van 1 cm. Bereid 2 50 mL buisjes met 10 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng de proximale en distale deel van de dunne darm (en de dikke darm indien van toepassing) afzonderlijk aan de buizen. Houd de buisjes op het ijs terwijl de darmen van extra muizen worden ontleed. Verzamel alle intestinale delen van één nest samen in dezelfde buis.Opmerking: een nest heeft meestal 6-10 fetuses. De darmen van alle foetussen moeten worden gecombineerd. Dit bedrag moet voldoende zijn om 4-8 putten te leveren met organoïden, in een 48-putplaat, per darm deel. Ga verder met organoïde-isolatie zoals eerder beschreven11. Kortom, het wassen van darm stukken met ijskoude PBS, incuberen met 2 mm ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 30 minuten bij 4 °c, distantiëren de crypten van het weefsel door het hard wassen van de stukken met ijskoud PBS + 10% foetaal kalf serum (FCS), filter met behulp van een 70 μm celzeef en centrifuge om de crypten te verzamelen bij 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Plaat 4 tot 8 putten met crypten in extracellulaire matrix gel, afhankelijk van de korrelgrootte, in een warme 48-goed plaat. Gebruik 20 μL crypten gesuspendeerd in extracellulaire matrix gel per put. Laat de extracellulaire matrixgel gedurende 10 minuten stollen in een incubator van 37 °C.Opmerking: gezien het feit dat slechts 40% tot 50% van de geïsoleerde crypten organoïden vormen, streven naar een dichtheid van 250 tot 300 organoïden per put. Voeg eerst minder extracellulaire matrix gel toe dan nodig. Kijk onder de Microscoop na het platting van de eerste put om te analyseren of de dichtheid van de geïsoleerde crypten ideaal is. Voeg indien nodig meer extracellulaire matrix gel toe. Bereid ondertussen ENR-medium: 14 mL gevorderd Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium/Ham F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (aangevuld met 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 1x, L-glutamine 0,01 M en 0,2 e/mL Penicillaire/streptomycine), 4 mL met Noggin geconditioneerde media, 2 mL Rspondin-400 μL van B27 supplement 1x, 200 μL N2-supplement 1x, 50 μL van 1,25 mM n-Acetylcysteïne, 20 μL van 0,05 μg/mL epidermale groei factor (EFG).Opmerking: bij het kweken van Colon organoïden, supplement met 50% WNT geconditioneerde media. Voeg 250 μL ENR-medium per put toe. 2. kweken van foetale organoïden Verander het medium van de culturen 3 keer per week. Rijping van de organoïden wordt bereikt na 1 maand cultuur. Tel op dag 3 na elke passage het aantal sferoïden en organoïden met behulp van een optische Microscoop. Kwantificeer ten minste 3 putjes per aandoening en alle organoïden die in elk putje aanwezig zijn.Opmerking: het aantal sferoïden vermindert met de tijd, terwijl het aantal organoïden toeneemt (Figuur 2). Doorgang de organoïden eenmaal per week door mechanische dissociatie zoals hieronder beschreven. Verwijder medium en voeg 1 mL ijskoude Advanced DMEM/F12 1:1 + + + toe. Verzamel alle extracellulaire matrix gels met organoïden in een buis van 15 mL. Gebruik een 200 μL Tip bovenop een filterpunt van 1000 μL en Pipetteer 20 keer omhoog en omlaag om de organoïden te verstoren. Centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 20 μL extracellulaire matrix gel per put. Meestal kunnen foetale organoïden worden uitgebreid in een verhouding van 1:2. Laat extracellulaire matrix gel stollen voor 5-10 min. Voeg 250 μL ENR medium per put toe. 3. maturatie analyse op RNA en eiwit niveau Analyseer elke 3 dagen na elke passage de cultuur gedurende een periode van 1 maand (d.w.z. de tijd waarin de volledige rijping is bereikt) (Figuur 3).Opmerking: foetale organoïde cultuur is dynamisch (film 1) en om variatie van de normale regeneratie van organoïden na mechanische verstoring te voorkomen, is het noodzakelijk om altijd monsters te verzamelen op dezelfde dag na de passage. RNA-isolatie Verzamel 3 putten van organoïden met 200 μL RNA lysisbuffer voor elke goed aangevuld met 2 μL β-mercaptoethanol. Na het toevoegen van RNA lysis buffer + β-mercaptoethanol aan de put, zorg ervoor dat alle extracellulaire matrix gel met organoïden wordt overgebracht naar een RNase-vrije 1,5 mL buis. Vortex krachtig en houd bij-80 °C gedurende niet langer dan 1 maand. Isoleren van RNA met behulp van commercieel beschikbare silica spin kolom Kits. Om de kwaliteit van RNA te verhogen, Voeg na het wassen van de stappen 500 μL van 80% EtOH toe en meng zachtjes door de kolom te inverteren. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 11.000 x g om de kolom volledig te drogen.Opmerking: Zorg ervoor dat de binnenkant van de deksel van de buis te wassen met de 80% EtOH door te flikken de buis ondersteboven drie tot vijf keer om zich te ontdoen van alle sporen van guanidine thiocyanaat. Om RNA-opbrengst te verhogen, wacht 1-2 min na het aanbrengen van RNase-vrij water voor centrifuge. Re-elueren RNA door het toepassen van de eerste doorstromings elaat aan de kolom een tweede keer.Opmerking: geïsoleerde RNA-kwaliteit is voldoende voor gebruik in Genome-wide expressie analyse. Controleer of het RNA-integriteits nummer hoger is dan 8. Eiwit isolatie Verzamel 5 putten van organoïden met behulp van 250 μL ijskoude cel herstel oplossing in 1 15 mL Tube. Inbroed gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de extracellulaire matrix gel op te lossen (dit zal de eiwit bijdrage van de extracellulaire matrix gel verminderen). Wassen met ijskoude PBS. Voeg 250 μL cellysisbuffer toe en bewaar bij-80 °C.Let op: na sonicatie kunnen monsters worden gebruikt om enzymactiviteit of voor westerse blots te detecteren. Immunokleuring Verzamel 2 putten van organoïden met behulp van 250 μL ijskoude celherstel oplossing in een buis van 15 mL. Inbroed gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de extracellulaire matrix gel op te lossen (dit zal de achtergrond van vlekken verminderen). Wassen met ijskoude PBS. Bevestig de organoïden met 500 μL van 4% paraformaldegyde (PFA) gedurende 1 uur bij 4 °C. Wassen met ijskoude PBS. Ga naar de volledige organoïde immunofluorescentie of naar paraffine insluiten volgens de gepubliceerde protocollen12.Opmerking: gebruik een plastic Pasteur-pipet om de organoïden af te handelen. Dit voorkomt verstoring van de structuur. 4. effect van Extrinsieke factor (Dexamethason als voorbeeld) op organoïde rijpingsproces Voeg op dag één van de cultuur 0,01 M dexamethason toe aan de organoïden. Inincuberen van de organoïden met dexamethason gedurende de hele maand van de cultuur door het toevoegen van nieuwe dexamethason elke keer medium wordt gewijzigd. Genexpressie analyse Isoleer RNA zoals hierboven beschreven. Synthetiseren, op hetzelfde moment, cDNA van alle monsters te vergelijken (behandeld en onbehandeld). Ga verder met de gewenste qRTPCR-methode. Gebruik GeNorm om het twee meest stabiele referentie-gen te identificeren telkens wanneer een nieuwe behandeling wordt toegepast op de foetale organoïden. Gebruik het geometrische gemiddelde van de twee gekozen referentie genen voor berekeningen van de relatieve expressie.Opmerking: suggesties voor referentie genen om te testen op foetale organoïden van muizen: Cyclohiline, Gapdh, βactin, 36b4, HPRT, Rpl4, Rpl32, Ppib en tbp. Om te onderzoeken hoe een bepaalde extrinsieke factor de postnatale muis foetale rijping beïnvloedt, moeten alle volgende genen worden geëvalueerd. Controleer of foetale markers lactase (LCT), argininosuccinaat synthase 1 (Ass1), B lymfocyten-geïnduceerde rijping proteïne 1 (Blimp-1) en neonatale FC receptor (fcrn) in expressie tijdens de eerste twee weken van de cultuur en zijn afwezig voor de resterende cultuur tijd (figuur 4c). Analyseer of dit patroon wordt gewijzigd. Controleer of volwassen markers sucrase-isomaltase (SIS), arginase 2 (Arg2), trehalase (treh) en lysozym (lyz) toenemen in expressie na twee weken van cultuur (figuur 4D). Analyseer of dit patroon wordt gewijzigd door de externe factor.Opmerking: Dexamethason is een externe factor die de rijping van de foetale organoïden kan versnellen en kan worden gebruikt als een positieve controle in alle experimenten die gericht zijn op het testen van andere extrinsieke factoren. Enzymactiviteit analyse Isoleer eiwitten zoals hierboven beschreven. Detecteer intestinale disaccharidases activiteit volgens de protocollen die zijn gepubliceerd door Dahlqvist en Messer13,14. Bereid 0,625 M maleïnezuur-buffer pH 6,0 (bewaren gedurende 3 maanden bij 4 °C). Bereid met deze buffer 0,05 M lactose (Voeg p-hydroxymercuribenzoaat natrium toe als stabilisator om lysosomale p-galactosidase-activiteit te remmen); 0,05 M maltose; 0,05 m sucrose en 0,05 M trehalose.Let op: al deze oplossingen kunnen 5 dagen worden bewaard bij 4 °C. Blijf op ijs tijdens het bereiden van assay. Bereid de testnormen voor door verdunning van 5,56 M glucoseoplossing met ultrapuur water om oplossingen te verkrijgen met de volgende concentraties: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m en 0,025 M.Opmerking: oplossing stabiel gedurende ten minste 3 maanden bij 4 °C. Inincuberen in een 96-put plaat voor 60 min bij 37 °C:-30 μL organoïd lysaat met 30μL lactose-30 μL organoïd lysaat met 30μL sucrose-30 μL van tien keer verdund organïd lysaat met 30 μL maltose-30 μL van vijf maal verdund organïd lysaat met een trehalase van 30 μL-30 μL onverdund organoïde lysaat met 30 μL maleïnezuur, als monster achtergrond-30 μL van elke glucose standaard-30 μL ultrapuur water, als blanco-30 μL positieve controle (verdunning optimaliseren; gelyseerd foetale intestinale weefsel kan worden gebruikt als controle voor lactase activiteit terwijl gelyseerd volwassen intestinale weefsel kan worden gebruikt als controle voor sucrase, Maltase en trehalase)Opmerking: verdunning van de monsters moet worden gemaakt met cellysisbuffer. Houd de monsters en de plaat op het ijs tijdens het bereiden van de test. Om de hoeveelheid glucose te bepalen die wordt geproduceerd door de enzymen die aanwezig zijn in het organoïde lysaat na incubatie met hun respectieve substraten, Voeg snel 200 μL PGO-Color oplossing toe en meet de extinctie bij 450 nm elke 5 min gedurende 30 min bij 37 °C.Opmerking: Maak de PGO-Color-oplossing fris. Gebruik 10 e/mL glucose-oxidase, 2 U/mL peroxidase en 7,88 mmol/L o-dianisidine in 0,5 mol/L tris-HCl buffer bij pH 7,0. De oplossing moet op kamertemperatuur zijn wanneer deze aan de plaat wordt toegevoegd. Bereken de activiteit volgens de glucose norm en corrigeer voor de totale hoeveelheid eiwit (bepaald door bicinchoninic acid assay (BCA)). Enzymactiviteit moet worden uitgedrukt als μM glucose/μg eiwit · min-1 (Figuur 5b).Opmerking: het meten van arginase activiteit met behulp van een commercieel beschikbare arginase activiteit assay kit.