Fetal Intestinal Organoidler Kullanılarak Tüp Bebek Teyidi--Weaning Geçiş

Bu çalışma, Amsterdam Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından, hayvanların bilimsel amaçlarla kullanılması için 2010/63/EU sayılı Avrupa direktifi (ALC312) uyarınca hayvan araştırmaları hakkındaki ulusal mevzuata tam olarak uygun olarak kurulan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. 1. Fetal ince bağırsak organoidlerinin izolasyonu Onaylanan etik düzenlemelere göre E18-E20 fetuslarını cerrahi makasla kafa keserek kurban edin. Ötanaziden hemen sonra, dikkatle bağırsak makas ile fetüsün alt karın açık kesmek ve tüm bağırsak kaldırın.NOT: Uygun emzirme-sütür geçişi ve olgunlaşmaini sağlamak için gebeliğin E18 ve E20’si arasında bağırsaklarda izolasyon yapılmalıdır. İki küçük çalgılarla bağırsağı uzat. Kılavuz olarak mide ve apandis kullanarak, ince bağırsağın proksimal ve distal kısmını kesip.NOT: Diseksiyonu dikkatlice yapılırsa kolon izole etmek de mümkündür. Kılavuz olarak ek kullanarak parçalara ayırın (Şekil 1). Bağırsağın uzunlamasına açılmasını sağlamak: uzunlamasına yerleştirilen bir jilet kullanarak bağırsağı düzeltin ve tıraş bıçağı boyunca çalgılar (jiletin her iki tarafındaki bir kolu) kayarak bağırsağı çekin. Daha sonra, 1 cm adet açılan bağırsak kesti. 10 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki adet 50 mL tüp hazırlayın. İnce bağırsağın proksimal ve distal kısmını (ve varsa kolonu) tüplere ayrı ayrı aktarın. Ek farelerin bağırsaklarını parçalarken tüpleri buzüzerinde tutun. Aynı tüp içinde birlikte bir çöp tüm bağırsak parçaları toplamak.NOT: Bir çöp genellikle 6-10 fetus vardır. Tüm fetusların bağırsakları birleştirilmelidir. Bu miktar, bağırsak kısmı başına 48 kuyuluk tasimi ile 4-8 kuyu vermeye yeterli olmalıdır. Daha önce açıklandığı gibi organoid izolasyon ile devam11. Kısacası, buz gibi PBS ile bağırsak parçaları yıkayın, 4 °C’de 30 dakika boyunca 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile kuluçkaya yatırın, parçaları buz gibi PBS + fetal buzağı serumu (FCS) ile sert bir şekilde yıkayarak, 150 x g’de 150 x g’de 4 °C’de 5 dakika boyunca kriptoları toplamak için filtre uygulayArak, 30 dakika boyunca dokudan ayrıştırın. Plaka 4-8 ekstrasellüler matris jel crypts ile kuyular, pelet boyutuna bağlı olarak, sıcak bir 48-iyi plaka. Her kuyuda ekstrasellüler matris jeliçinde asılı 20 μL’lik mahzen kullanın. Hücre dışı matriks jelinin 37 °C’lik bir kuluçka makinesinde 10 dakika boyunca katılamasına izin verin.NOT: İzole edilmiş mahzenlerin sadece ila ‘sinin organoid ler oluşturduğu düşünülürse, kuyu başına 250 ila 300 organoid yoğunluğu hedeflenir. İlk gerekenden daha az ekstrasellüler matris jel ekleyin. İzole edilmiş mahzenlerin yoğunluğunun ideal olup olmadığını analiz etmek için ilk kuyuyu platting sonra mikroskop altına bakın. Gerekirse, daha fazla hücre dışı matris jel ekleyin. Bu arada ENR orta hazırlamak: 14 mL Gelişmiş Dulbecco’s Modifiye Kartal Orta / Ham’s F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (4-(2-hidroksitil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) 1x ile desteklenmektedir, L-glutamin 0.01 M ve 0.2U/mL Penisilin/Streptomisin), 4 mL Noggin klimalı ortam, 2 mL Rspondin klimalı ortam, 400 μL B27 takviyesi 1x, 200 μL N2 takviyesi 1x, 50 μL 1.25 mM n-Asetilsistein, 20 μL 0.05 μg/mL Epidermal Büyüme Faktörü (EGF).NOT: Kolon organoidleri kültürlenirken, Wnt şartlı ortam ile tamamlanır. Kuyu başına 250 μL ENR orta ekleyin. 2. Fetal organoidlerin culturing Kültürlerin ortasını haftada 3 kez değiştirin. Organoidlerin olgunlaşması 1 aylık kültürden sonra sağlanır. Her pasajdan sonra 3. Durum başına en az 3 kuyu ve her kuyuda bulunan tüm organoidleri ölçün.NOT: Spheroidlerin sayısı zamanla azalırken, organoid sayısı artar (Şekil 2). Aşağıda açıklandığı gibi mekanik dissosilasyon ile organoidler haftada bir kez passage. Orta çıkarın ve buz gibi Gelişmiş DMEM/F12 1:1 +++1 mL ekleyin. 15 mL tüp içine organoidler ile tüm ekstrasellüler matriks jel toplayın. Organoidleri bozmak için 1000 μL filtre ucunun üstüne 200 μL’lik bir uç ve 20 kat yukarı ve aşağı pipet kullanın. Santrifüj 150 x g’de 5 dk 4 °C’de. Supernatant atın ve iyi başına ekstrasellüler matris jel 20 μL pelet resuspend. Genellikle fetal organoidler 1:2 oranında genişletilebilir. Hücre dışı matriks jel5-10 dakika katılaşmasağlar. 3. RNA ve protein düzeyinde olgunlaşma analizi Her pasajdan sonra her 3 günde bir kültürü 1 aylık bir süre için analiz edin (yani tam olgunlaşmanın gerçekleştiği zaman)(Şekil 3).NOT: Fetal organoid kültür dinamiktir (Film 1) ve mekanik bozulma dan sonra organoidlerin normal rejenerasyon varyasyonönlemek için, her zaman geçişten sonra aynı gün örnek toplamak için gereklidir. RNA yalıtımı 2 μL β-mercaptoetanol ile desteklenen her kuyu için 200 μL RNA lysis tamponu kullanarak 3 adet organoid toplayın. Kuyuya RNA lysis tampon+β-mercaptoetanol ekledikten sonra, organoidli tüm hücre dışı matriks jelin rnase içermeyen 1.5mL tüpe aktarıldığından emin olun. Girdap şiddetle ve en fazla 1 ay süreyle -80 °C’de tutun. RNA’yı ticari olarak kullanılabilen silika spin kolon kitleri kullanarak izole edin. RNA kalitesini artırmak için, yıkama adımlarından sonra EtOH’a 500 μL ekleyin ve sütunu ters çevirerek hafifçe karıştırın. 11.000 x g’de 2 dk santrifüj kolon tamamen kuru.NOT: Guanidin tiyosiyanattüm izleri kurtulmak için tüp baş aşağı üç ila beş kez flicking tarafından% 80 EtOH ile tüp kapağının iç yıkama emin olun. RNA verimini artırmak için santrifüjden önce RNase içermeyen su uyguladıktan sonra 1-2 dakika bekleyin. Sütuna gelen ilk akışı ikinci kez uygulayarak RNA’yı yeniden elayın.NOT: Genom genelinde ifade analizinde izole RNA kalitesi yeterlidir. RNA bütünlük numarasının 8’in üzerinde olup olmadığını kontrol edin. Protein izolasyonu Bir 15 mL tüp içine 250 μL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi kullanarak organoidlerin 5 kuyu toplayın. Ekstrasellüler matriks jeli eritmek için en az 30 dakika buz üzerinde kuluçka (bu ekstrasellüler matriks jel protein katkısını azaltacaktır). Buz gibi PBS ile yıkayın. 250 μL hücre lisis tamponu ekleyin ve -80 °C’de saklayın.NOT: Sonication sonra, örnekler enzim aktivitesini tespit etmek veya Batı Lekeler için kullanılabilir. İmmünoboyama 15 mL’lik bir tüpe 250 μL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi kullanarak 2 kuyu organoid toplayın. Ekstrasellüler matris jel ilerler (bu arka plan boyama azaltacaktır) buz üzerinde en az 30 dakika kuluçka. Buz gibi PBS ile yıkayın. 4 °C’de 1 saat boyunca %4 paraformaldegyde (PFA) 500 μL kullanarak organoidleri düzeltin. Buz gibi PBS ile yıkayın. Yayınlanan protokollere göre tüm organoid immünofluoresans veya parafin katıştırma devam edin12.NOT: Organoidleri işlemek için plastik pasteur pipetkullanın. Bu, yapısının bozulmasını önleyecektir. 4. Dışsal faktörün (örnek olarak deksametazon) organoid olgunlaşma sürecine etkisi Kültürün ilk gününde, organoidlere 0.01M deksametazon ekleyin. Her zaman ortam değiştiğinde yeni deksametazon ekleyerek tüm kültür ayı boyunca organoidleri deksametazon ile kuluçkaya yatırın. Gen ekspresyonu analizi Yukarıda açıklandığı gibi RNA’yı yalıtın. Sentez, aynı zamanda, tüm örneklerin cDNA karşılaştırıldığında (tedavi ve tedavi edilmez). Tercih edilen qRTPCR yöntemi ile devam edin. Fetal organoidler üzerinde her yeni bir tedavi kullanıldığında en istikrarlı iki referans geni tanımlamak için GeNorm kullanın. Göreceli ifade hesaplamaları için seçilen iki referans geninin geometrik ortalamasını kullanın.NOT: Fare fetal organoidleri için test etmek için referans genönerileri: Siklofilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib ve Tbp. Belirli bir dışsal faktörün doğum sonrası fare fetal matürasyonunu nasıl etkilediğini araştırmak için aşağıdaki genlerin tümü değerlendirilmelidir. Fetal belirteçler laktaz (Lct), argininosuccinate synthase 1(Ass1),B lenfosit kaynaklı olgunlaşma proteini 1 (Blimp-1) ve neonatal Fc reseptörü(FcRn)kültürün ilk iki haftasında ekspresyonda azalma olup olmadığını kontrol edin ve kalan kültür süresi için eksiktir(Şekil 4C). Bu desenin değiştirilip değiştirilmediğini analiz edin. Yetişkin belirteçleri sucrase-izomaltase(Sis), arginase 2(Arg2), trehalase (Treh) ve lizozim(Lyz) iki haftalık kültürden sonra ifadede artış olup olmadığını kontrol edin (Şekil 4D). Bu desenin dış faktör tarafından değiştirilip değiştirilmediğini analiz edin.NOT: Deksametazon fetal organoidlerin olgunlaşmasını hızlandıran ve diğer dışsal faktörleri test etmeyi amaçlayan tüm deneylerde pozitif kontrol olarak kullanılabilen dış saldir. Enzim aktivite analizi Yukarıda açıklandığı gibi protein izole. Dahlqvist ve Messer13,14tarafından yayınlanan protokollere göre bağırsak disaccharidases aktivitesini tespit edin. 0,625 M maleik tampon pH 6.0 hazırlayın (4 °C’de 3 ay bekletin). Bu tampon kullanarak, 0.05 M laktoz hazırlamak (lizozomal p-galaktosidaz aktivitesini inhibe etmek için stabilizatör olarak p-hidroksimercuribenzoate sodyum ekleyin); 0.05 M maltoz; 0.05 M sakaroz ve 0.05 M trehalose.NOT: Tüm bu çözeltiler 4 °C’de 5 gün saklanabilir. Tislama hazırlarken buz üzerinde tutun. Aşağıdaki konsantrasyonlarda çözelti elde etmek için 5,56 M glikoz çözeltisini ultra saf suile seyrelterek ölçüm standartlarını hazırlayın: 0,125 M; 0,1 M; 0.075 M; 0,05 M ve 0,025 M.NOT: çözelti 4 °C’de en az 3 ay stabildir. 37 °C’de 60 dk boyunca 96 kuyulu bir tabakta kuluçka:- 30 μL organoid lysate 30μL laktoz ile- 30 μL organoid lysate 30μL sakaroz ile- 30 μL maltoz ile seyreltilmiş organoid lysate on kez 30 μL- 30 μL beş kez seyreltilmiş organoid lisat ile 30 μL trehalase- 30 μL seyreltilmemiş organoid lisat 30 μL maleik asit ile, örnek arka plan olarak- Her glikoz standardının 30 μL- 30 μL ultrasaf su, boş olarak- 30 μL pozitif kontrol (optimize seyreltme; lysed fetal bağırsak dokusu laktaz aktivitesi için kontrol olarak kullanılabilirken, lysed yetişkin bağırsak dokusu sucrase, maltase ve trehalase için kontrol olarak kullanılabilir)NOT: Örneklerin seyreltilmesi hücre lisis tamponu ile yapılmalıdır. Titreyi hazırlarken numuneleri ve plakayı buz üzerinde tutun. Organoid lysate’de bulunan enzimlerin kendi substratlarıyla kuluçkadan sonra ürettiği glikoz miktarını belirlemek için, 37 °C’de 30 dakika boyunca her 5 dakikada 450 nm’de 200 μL PGO rengi çözeltisi ekleyin ve emiciliği ölçün.NOT: PGO-renk çözümtaze olun. PH 7.0’da 0.5mol/L Tris-HCl tamponunda 10 U/mL glukoz-oksidaz, 2 U/mL peroksidaz ve 7.88 mmol/L o-dianisidin kullanın. Çözelti, tabağa eklendiğinde oda sıcaklığında olmalıdır. Aktiviteyi glukoz standardına göre hesaplayın ve toplam protein miktarı için doğru (bicinchoninic asit tayı (BCA) ile belirlenir). Enzim aktivitesi μM glukoz/μg protein·min-1 olarak ifade edilmelidir (Şekil 5B).NOT: Ticari olarak kullanılabilen arginaz aktivite istifinkitini kullanarak arginaz aktivitesini ölçün.