Cultivo, manipulación y trasplante ortotópico de organoides tumorales de la vejiga de ratón

Todos los procedimientos fueron aprobados y llevados a cabo bajo las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en POSTECH (Número IACUC: POSTECH-2019-0055). 1. In Vitro Culture of Bladder Tumor Organoids Establecer organoides tumorales de vejiga a partir del tumor de vejiga murina (Figura 1Un).NOTA: El procedimiento para generar tumores de vejiga de ratón inducidos por BBN se describe en Shin et al.17.Proporcione un 0,1% de agua que contenga BBN en una botella oscura al ratón ad libitum durante 6 meses. Cambiar el agua que contiene BBN 2 veces a la semana.NOTA: Se utilizó un ratón macho C57BL/6 con un peso corporal de aproximadamente 25 g a 8-10 semanas de edad. El agua que contiene BBN se puede administrar hasta cinco ratones en una sola jaula. Después de 6 meses, eutanasia el ratón con inhalación de dióxido de carbono y aísle todo el tumor de la vejiga. Transfiéralo a un plato Petri de 90 mm. Retire las partes no cancerosas y las regiones necróticas utilizando tijeras quirúrgicas estériles y lave los fragmentos del tumor de la vejiga de 2 a 3 veces con una salina fría de 1x de Dulbecco con búfer de fosfato (DPBS). Recoge los fragmentos y transfiéralos a una nueva placa Petri de 90 mm. Añadir 1 ml del medio esencial mínimo modificado (DMEM) de Dulbecco con 10 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES). Picar el tejido tumoral en trozos lo más pequeños posible (0,5-1 mm3) usando una cuchilla de afeitar esterilizada. Añadir 9 ml de DMEM con 10 mM HEPES, 250 g/mL de colagenasa tipo I, 250 g/ml de colagenasa tipo II y 250 U/ml de termólisina. Incubar el tejido tumoral picado durante 1,5–2 h en un agitador orbital en una incubadora (37 oC, 5% CO2)para disociar los fragmentos en la suspensión celular. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml.NOTA: Si el tamaño del tumor cosechado del ratón es superior a 1 cm3, tratarlo con 2 veces la cantidad de termolisina o aumentar el tiempo de incubación. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar al sobrenadante. Resuspenda el pellet usando 5 ml de tampón de lising de amonio-cloruro-potasio (ACK) para oxidar los glóbulos rojos. Incubar el tubo durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT) hasta la lisis completa de los glóbulos rojos.NOTA: Si no se observan los glóbulos rojos, omita el proceso de lising. Añadir 20 ml de DMEM en el tubo. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar al sobrenadante. Resuspenda el pellet con 1 ml de 0,25% de trippsina-EDTA y dihidrocloruro De-27632 de 10 m (Y-27632) para disociar el pellet en células individuales. Incubar el tubo durante 5 minutos en un baño de agua de 37 oC.NOTA: Observe el tumor bajo un microscopio para confirmar la disociación completa en células individuales. Si los trozos de células persisten, pipetee aún más la suspensión. Neutralizar la trippsina usando 10 mL de DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS). Filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de 100 m en un nuevo tubo de 50 ml para eliminar los desechos no digeridos. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar al sobrenadante. Recubrir un pozo en una placa de 24 pozos usando 150 s de factor de crecimiento en frío reducido matriz de membrana de sótano(Tabla de Materiales)y colocar la placa de 24 pozos en una incubadora (37 oC, 5% CO2) durante 30 minutos para solidificar la matriz de membrana de sótano.NOTA: Descongelar y mantener la matriz de membrana del sótano a 4 oC para evitar la solidificación antes de su uso. Resuspenda el pellet usando 1 ml de DMEM y cuente las células usando un hemocitómetro. Transfiera de 3 a 4 x 104 células tumorales a un microtubo de 1,5 ml sobre hielo. Centrifugar el microtubo a 400 x g durante 3 min a 4 oC y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspenda las células con 500 ml de medio organoides precalentado(Tabla 1) y 10 OM Y-27632 y transfiéralas al pozo recubierto. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora (37 oC, 5% CO2). Las células tumorales vesicales adicionales se pueden abastecer con 1 ml de DMEM que contiene 10% DE FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en crioviales de 1,5 ml. Colóquelos en un recipiente de congelación criovial y transfiera el recipiente a un congelador de -80 oC. Después de su almacenamiento en el congelador durante la noche, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Cambiar el medio cada 2 días utilizando 500 ml de medio organoide precalentado(Figura 1B). Organoides tumorales de vejiga de subcultivo.NOTA: Se recomienda el paso de los organoides tumorales de la vejiga cuando alcanzan los 100-150 m de diámetro. Añadir 500 l de colagenasa/dispensa al medio organoide en la placa de 24 pocillos con organoides tumorales. Pipetear arriba y abajo de la matriz de membrana del sótano y el medio. Incubar durante 20 min a 37oC y cosechar las células en un tubo de 15 ml.NOTA: Examine los organoides aislados de la matriz de membrana del sótano bajo un microscopio. Si los organoides no se separan de la matriz de membrana del sótano, aumente el tiempo de incubación o la pipeta más veces. Añadir 5 ml de DMEM precalentado, centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante. Resuspenda el pellet usando 1 ml de trippsina-EDTA precalentado al 0,25% y 10 m Y-27632. Incubar durante 5 min en un baño de agua de 37oC. Pipetear vigorosamente las células hacia arriba y hacia abajo y neutralizar la trippsina usando 5 ml de DMEM con 10% FBS. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 oC y aspirar al sobrenadante. Resuspende el pellet usando 1 ml de medio organoide precalentado y cuenta el número de células tumorales individuales. Repita los pasos 1.1.14-1.1.18. 2. Manipulación Genética de Organoides Tumorales de Vejiga Utilizando Transducción Mediada por Lentivirus (Figura 2A) Producir las partículas lentivirales que expresan la GFP. En el día 0, células HEK 293T de placa a una densidad de 5-6 x 106 células por placa de cultivo celular de 10 cm en el medio de cultivo de línea celular (es decir, DMEM con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina). En el día 1, prepare la solución de transfección de ADN, incluido el plásmido de transferencia que contenga GFP (8 g), plásmido de envase sin mandatar (10 g de pCMVR 8,74 y 3 g de pMD2.G) y 1 ml de medio sérico reducido(Tabla de materiales). Añadir 3 l de reactivo de transfección(Tabla de materiales)por 1 g de plásmido total de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar suavemente mediante pipeteo. Incubar durante 20 min a RT y añadir 9 mL de DMEM con 10% FBS. Aspirar el medio de cultivo en la placa de cultivo celular con células HEK 293T. Transfiera cuidadosamente 10 ml de la solución de transfección de ADN a las células HEK 293T e incubar en una incubadora de cultivo celular a 37 oC. El día 3, observe las células bajo un microscopio de fluorescencia (excitación a 488 nm y emisión a 512 nm) para determinar la eficiencia de transfección. Casi el 90%-100% de las células de toda la población celular deben expresar la PTF. Recoger el sobrenadante (que contiene el virus) y filtrar el sobrenadante con un filtro de poliétersulfone (PES) de 0,45 m.NOTA: Utilice un filtro de unión a proteínas bajo, como un filtro PES. Para concentrar el virus, centrifugar el sobrenadante del virus a 98.768 x g en una ultracentrífuga durante 2 h a 4 oC en un rotor de cubo oscilante(Tabla de materiales)y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en 2,5 ml de medio organoide frío. Para el almacenamiento a largo plazo, la alícuota de 250 ml de medio lentiviral en viales criogénicos y la congelación instantánea utilizando nitrógeno líquido. Almacene las existencias virales congeladas en un congelador de -80 oC. Realizar una transducción mediada por lentivirus de los organoides del tumor de la vejiga. En el día 2, divida los organoides tumorales como se describió anteriormente (paso 1.2) 12 h antes de la transducción mediada por lentivirus. En el día 3, descongelar rápidamente una alícuota (paso 2.1.9) que contenga virus en un baño de agua de 37oC y añadir los 250 ml de medio organoides con 10 M Y-27632 y bromuro de hexadimetrina de 8 g/ml. Sustituya el medio organoide de la placa de 24 pocillos por organoides tumorales por 500 ml de medio que contiene virus e incubar durante 12-16 h en una incubadora (37 oC, 5% CO2). En el día 4, cambiar el medio con 500 ml de medio organoide fresco.NOTA: Después de 12-16 h de incubación, el medio debe cambiarse, porque el medio que contiene lentivirus y bromuro de hexadimetrina es citotóxico. El día 6, monitoree la señal GFP de los organoides tumorales 3 días después de la transducción bajo un microscopio de fluorescencia(Figura 2B). En el día 10, pasar y almacenar los organoides 7 días después de la transducción como se describe en el paso 1.2, para mantener las líneas organoides tumorales modificadas genéticamente. 3. Trasplante ortotópico de organoides de la vejiga(Figura 3A) Preparar los organoides tumorales de la vejiga para el trasplante ortotópico. Antes del trasplante, cultivo de los organoides tumoral de la vejiga durante 5-7 días, como se describió anteriormente (paso 1.2). Añadir 500 ml de colagenasa/dispensa al medio organoide en una placa de 24 pocillos con los organoides tumorales. Pipetear arriba y abajo de la matriz de membrana del sótano y el medio. Incubar durante 20 min a 37 oC y recoger las células en un tubo de 15 ml. Añadir 5 ml de DMEM precalentado, centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante. Resuspenda el pellet con 1 ml de DMEM y transfiera la solución a una placa Petri de 90 mm. Bajo un microscopio, recoge los 10–100 organoides tumorales usando una micropipeta p200 y recógelos en un microtubo sobre hielo. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 oC y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Mantenga el pellet celular en hielo hasta que los ratones estén listos para la cirugía. Trasplante de pared submucosa de la vejigaNOTA: Este procedimiento se modifica del protocolo publicado por Fu et al18. Prepare un ratón desnudo macho de 8 a 10 semanas (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) al menos 1 semana antes del experimento para permitirle aclimatarse a un nuevo entorno. Inyectar enrofloxacino (5 mg/kg) por vía subcutánea 24 h antes de la cirugía. Limpie la superficie del banco con agua y jabón. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos antes del procedimiento quirúrgico y realizar la cirugía utilizando instrumentos estériles. Mantenga la jeringa de insulina de 29 G, las puntas de pipeta y la matriz de membrana del sótano en hielo. Administrar ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea antes de la administración de anestesia. Anestetizar el ratón con 4% de isoflurano en una cámara de inducción. Una vez alcanzada la anestesia general, coloque el ratón en una posición supina y mantenga la anestesia por inhalación de mascarilla de isoflurano vaporizado al 2%.NOTA: Si el tiempo de anestesia es de más de 30 minutos, aplique un ununción ocular en ambos ojos usando un hisopo de algodón para evitar el secado de la córnea. Aplicar povidona-yodo con una gasa estéril y limpiarlo con 70% de etanol. Repita 3x con una gasa nueva o un hisopo de algodón cada vez. Cubra el ano y el campo quirúrgico utilizando cortinas quirúrgicas desechables y estériles. Usando un microscopio de disección para el aumento, haga una pequeña incisión transversal (menor de 1,5 cm) en la piel y la pared muscular del abdomen de la línea media inferior con tijeras quirúrgicas estériles. Exponga la vejiga de la cavidad abdominal y apóyala con hisopos de algodón empapados en salina.NOTA: Si la vejiga está llena de orina, presione suavemente la vejiga para descomprimirla ligeramente. Resuspender los gránulos organoides (paso 3.1.7) en 80 ml de medio organoide que contenga una matriz de membrana de sótano de alta concentración del 50%(Tabla de materiales). Inyectar la suspensión organoide en el aspecto anterior de la cúpula de la vejiga utilizando la jeringa de insulina de 29 G bajo un microscopio de disección. Cierre la capa interna de la pared abdominal con sutura absorbible antibacteriana y luego cierre la capa externa con sutura de nylon 4-0. Desinfectar el sitio quirúrgico con povidona-yodo y 70% de etanol. Permita que el ratón se recupere bajo un irradiador infrarrojo de 10 a 15 minutos. Un día después de la cirugía, compruebe el estado general del ratón y la fuga anastomótica. Administrar ketoprofeno (5 mg/kg) una vez al día durante 3 días después de la operación y tratar la enrofloxacina (5 mg/kg) una vez al día durante 10 días después de la operación. Cuando el sitio de la incisión haya sanado (10-14 días después de la cirugía), retire las suturas. Controle el crecimiento del tumor de la vejiga del ratón durante 2-3 semanas después de la inyección de organoide tumoral. Si se observa un crecimiento del tumor en la vejiga, eutanasia el ratón mediante inhalación de dióxido de carbono y cosetodo todo el tumor de la vejiga. Lávelo con DPBS frío(Figura 3B)16. Para analizar la histología del tumor vesical, ten la sección incrustada en parafina del tejido mediante hematoxilina y tinción de eosina (H y E)(Figura 3B)16.