Культура, манипуляция и ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолей мышелового пузыря

Все процедуры были утверждены и проведены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных в POSTECH (iacUC номер: POSTECH-2019-0055). 1. В vitro Культура органоидов опухолей мочевого пузыря Установить органоиды опухоли мочевого пузыря из опухоли мочевого пузыря (Рисунок 1A).ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура генерации BBN-индуцированных опухолей мышелова из мыши изложена в Шин и др.17.Обеспечить 0,1% BBN-содержащих воды в темной бутылке мыши объявление libitum в течение 6 месяцев. Изменение BBN-содержащей воды 2x в неделю.ПРИМЕЧАНИЕ: Была использована мужская мышь C57BL/6 с массой тела около 25 г в возрасте 8-10 недель. BBN-содержащей воды можно управлять до 5 мышей в одной клетке. После 6 месяцев, эвтаназии мыши с помощью вдыхания углекислого газа и изолировать всю опухоль мочевого пузыря. Перенесите его на 90 мм чашку Петри. Удалить нераковые части и некротические области с помощью стерильных хирургических ножниц и мыть фрагменты опухоли мочевого пузыря 2-3 раза с холодной 1x Dulbecco в фосфат-буферный солей (DPBS). Соберите фрагменты и перенесите их в новую 90-мм чашку Петри. Добавьте 1 мл модифицированной минимальной незаменимой среды (DMEM) Dulbecco с 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанесульфоновой кислоты (HEPES). Фарш опухолевой ткани на куски, как можно меньше (0,5-1 мм3) с помощью стерилизованного лезвия бритвы. Добавьте 9 мл DMEM с 10 мм HEPES, 250 мкг/мл коллагеназе типа I, 250 мкг/мл коллагеназе ii типа и 250 U/mL термолизин. Инкубация рубленой опухолевой ткани на 1,5–2 ч на орбитальный шейкер в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2),чтобы разъединить фрагменты в клеточную подвеску. Перенесите суспензию клетки в трубку 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Если размер опухоли, собранной из мыши, превышает 1 см3,обработайте ее в 2 раза больше термолиза ни с то, сколько увеличьте время инкубации. Centrifuge трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 кв с и аспирации супернатанта. Приостановите гранулы с использованием 5 мл аммония-хлорида-калия (ACK) лизации буфера для линизации любых красных кровяных телец. Инкубировать трубку в течение 3-5 мин при комнатной температуре (RT) до полного лиза эритроцитов.ПРИМЕЧАНИЕ: Если красные кровяные тельца не наблюдаются, опустить процесс лизания. Добавьте 20 мл DMEM в трубку. Centrifuge трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 кв с и аспирации супернатанта. Отдохните гранулы с 1 мл 0,25% Трипсин-ЭДТА и 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид (Y-27632) для разъединения гранул на одиночные клетки. Инкубировать трубку в течение 5 минут в водяной бане 37 градусов.ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за опухолью под микроскопом, чтобы подтвердить полную диссоциацию на одиночные клетки. Если куски клеток сохраняются, pipette подвески дальше. Нейтрализовать трипсин с помощью 10 мл DMEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS). Фильтр клеточной подвески через 100 мкм ячейки ситечко на новой трубке 50 мл, чтобы удалить непереваренный мусор. Centrifuge трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 кв с и аспирации супернатанта. Пальто хорошо в 24 хорошо пластины с использованием 150 qL ледяного фактора роста снижение подвала мембранной матрицы(Таблица материалов) и поместить 24 хорошо пластины в инкубатор (37 КК, 5% CO2) в течение 30 минут, чтобы укрепить подвал мембранной матрицы.ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель и поддерживать подвальную мембранную матрицу при 4 градусах по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевание перед использованием. Приостановите гранулы с использованием 1 мл DMEM и посчитайте клетки с помощью гемоситометра. Перенесите 3-4 х 104 опухолевых клеток в микротрубку 1,5 мл на льду. Centrifuge микротрубки на 400 х г в течение 3 мин при 4 кв и осторожно отбросить супернатант. Приостановите работу клеток с 500 л предтеплой органоидной среды(таблица 1) и 10 МКм Y-27632 и перенесите их в колодец с покрытием. Поместите 24 пластины хорошо в инкубатор (37 кв.к., 5% CO2). Дополнительные опухолевые клетки мочевого пузыря могут быть снабжены 1 мл DMEM, содержащий 10% FBS, 1% пенициллина /стрептомицина, и 10% диметил сульфоксида (DMSO) в 1,5 мл криовиалы. Поместите их в кривиной замораживания контейнера и передать контейнер в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию. После хранения в морозильной камере на ночь, переложить криовиалы в жидкий азот для длительного хранения. Изменение среды каждые 2 дня с помощью 500 л предтеплой органоидной среды(рисунок 1B). Органоиды опухолевых опухолей мочевого пузыря.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется прохождение органов опухоли мочевого пузыря, когда они достигают 100-150 мкм в диаметре. Добавьте 500 кЛ коллагеназы/диспазы в органоидную среду в 24 хорошо пластины с опухолевыми органоидами. Пипетка вверх и вниз по подвалу мембраны матрицы и среды. Инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и собирать клетки в трубку 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Изучите органоиды, изолированные от мембранной матрицы под микроскопом. Если органоиды не отделены от мембранной матрицы, увеличьте время инкубации или пипетку больше раз. Добавьте 5 мл предварительно разогретого DMEM, центрифуги южан на 400 х г в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия, и аспирировать супернатант. Отсрояйте гранулы с использованием 1 мл предварительно разогретого 0,25% трипсина-ЭДТА и 10 МКМ Y-27632. Инкубировать в течение 5 мин в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Энергично pipette клетки вверх и вниз и нейтрализовать трипсин с помощью 5 мл DMEM с 10% FBS. Centrifuge трубку при 400 х г в течение 3 мин при 4 кв с и аспирации супернатанта. Приостановите гранулы с использованием 1 мл предтеплой органоидной среды и подсчитайте количество одиночных опухолевых клеток. Повторите шаги 1.1.14-1.1.1.18. 2. Генетическая манипуляция органов опухоли мочевого пузыря с использованием лентивирусно-опосредованного трансдукции(рисунок 2A) Производите GFP-выражения лентивирных частиц. На день 0, пластины HEK 293T клеток при плотности 5-6 х 106 клеток на 10 см клеточной культуры пластины в среде культуры клеточной линии (т.е., DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин). На 1-й день подготовьте раствор трансфекции ДНК, включающий плазмид переноса ГФП (8 мкг), лентивирусную упаковочную плазмиду (10 мкг pCMVR 8,74 и 3 мкг pMD2.G) и 1 мл пониженной среды сыворотки(Таблица материалов). Добавьте 3 Зл трансфекционного реагента(Таблица Материалов)на 1 мкг общей плазмиды в соответствии с инструкциями производителя и аккуратно перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 20 минут на RT и добавить 9 мл DMEM с 10% FBS. Аспирируйте среду культуры в плите культуры клетки с клетками HEK 293T. Тщательно перенесите 10 мл раствора трансфекции ДНК на клетки HEK 293T и инкубируйте в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия. На 3-й день наблюдайте за клетками под флуоресценционным микроскопом (возбуждение на уровне 488 нм и выброс на уровне 512 нм), чтобы определить эффективность трансфекции. Почти 90%-100% клеток в всей популяции клеток должны выражать GFP. Соберите супернатант (содержащий вирус) и фильтруйте супернатант фильтром политетерсульфона (PES) в размере 0,45 мкм.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фильтр с низким содержанием белка, такой как фильтр PES. Чтобы сконцентрировать вирус, центрифуга вирус супернатант на 98,768 х г в ультрацентрифуге для 2 ч при 4 квс в размахивая ротор ведро (Таблица материалов) и тщательно отказаться от супернатанта. Приостановите гранулы в 2,5 мл холодной органоидной среды. Для длительного хранения, aliquot 250 Л лентивирусной среды в криогенные флаконы и оснастки заморозить их с помощью жидкого азота. Храните замороженные вирусные запасы в морозильной камере -80 градусов. Выполните лецивирусно-опосредованный трансдукции органоидов опухоли мочевого пузыря. На второй день, разделить опухоли органоидов, как описано выше (шаг 1,2) 12 ч до лентивирусо-опосредованного трансдукции. На 3-й день быстро оттепель аликот (шаг 2.1.9), содержащий вирус в водяной бане 37 градусов по Цельсию и добавьте 250 л органоидной среды с 10 МКм Y-27632 и 8 мкг/мл г/мл гексадиметрина бромистого бромида. Замените органоидную среду в 24 хорошо пластины с опухолевыми органоидами на 500 л, содержащих вирус среды и инкубировать на 12-16 ч в инкубаторе (37 кв.к., 5% CO2). На 4-й день измените среду с 500 qL свежей органоидной среды.ПРИМЕЧАНИЕ: После 12-16 ч инкубации, среда должна быть изменена, потому что среда, содержащая лецивирус и бромистого гексадиметрина является цитотоксическим. На 6-й день следите за сигналом GFP от опухолевых органоидов через 3 дня после трансдукции под флуоресцентным микроскопом(рисунок 2B). На день 10, проход и запас органоидов 7 дней после трансдукции, как описано в шаге 1.2, для поддержания генетически модифицированных опухолевых органоидных линий. 3. Ортотопическая трансплантация органоида из мочевого пузыря(рисунок 3A) Подготовьте органоиды опухоли мочевого пузыря для ортотопической трансплантации. Перед трансплантацией культура органоидов опухоли мочевого пузыря в течение 5-7 дней, как описано выше (шаг 1.2). Добавьте 500 кЛ коллагеназы/диспазы в органоидную среду в 24 хорошо пластины с опухолевыми органоидами. Пипетка вверх и вниз по подвалу мембраны матрицы и среднего. Инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и собирать клетки в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл предварительно разогретого DMEM, центрифуги южан на 400 х г в течение 3 мин при 4 градусах Цельсия, и аспирировать супернатант. Отрежь гранулу 1 мл DMEM и перенесите раствор в 90 мм чашку Петри. Под микроскопом, забрать 10-100 опухолевых органоидов с помощью микропайпета p200 и собрать их в микротрубку на льду. Centrifuge трубку при 400 х г в течение 3 мин при 4 градусах по Цельсию и осторожно отбросьте супернатант. Поддерживайте клеточные гранулы на льду до тех пор, пока мыши не будут готовы к операции. Трансплантация стенки пузыри подмукосаПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена из протокола, опубликованного Fu et al18. Подготовьте от 8 до 10 недель мужской обнаженной мыши (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) по крайней мере за неделю до эксперимента, чтобы позволить ему акклиматизироваться к новой среде. Вводят энрофлоксацин (5 мг/кг) подкожно 24 ч перед операцией. Очистите поверхность скамейки мылом и водой. Автоклав хирургические инструменты до хирургической процедуры и выполнять операции с использованием стерильных инструментов. Держите 29 G инсулиншшприц, пипетки советы, и подвал мембраны матрицы на льду. Администрирование кетопрофена (5 мг/кг) подкожно перед введением анестезии. Анестезируйка мыши с 4% изолюран в индукционной камере. После достижения общей анестезии положите мышь в положение на спине и поддерживайте анестезию путем вдыхания маски 2% испаряемого изофрурана.ПРИМЕЧАНИЕ: Если время анестезии составляет более 30 минут, нанесите мазь для глаз на оба глаза с помощью ватного тампона, чтобы избежать высыхания роговицы. Нанесите повидон-йод стерильной марлей и протрите его 70% этанола. Повторите 3x с новой марлей или ватным тампоном каждый раз. Обложка ануса и хирургического поля с помощью одноразовых, стерильных хирургических штор. Используя расчленяющий микроскоп для увеличения, сделайте небольшой поперечный разрез (меньше 1,5 см) в коже и мышечной стенке нижней средней линии живота стерильными хирургическими ножницами. Выставить мочевой пузырь из брюшной полости и поддержать его солен-пропитанными ватными тампонами.ПРИМЕЧАНИЕ: Если мочевой пузырь полон мочи, осторожно нажмите мочевой пузырь, чтобы распаковать его немного. Повторите органоидные гранулы (шаг 3.1.7) в 80 ЗЛ органоидной среды, содержащей 50% высокой концентрации подвальной мембранной матрицы(Таблица Материалов). Введите органоидную суспензию в передний аспект купола мочевого пузыря, используя 29 G инсулиновый шприц под рассекающим микроскопом. Закройте внутренний слой брюшной стенки антибактериальным абсорбируемым швом, а затем закройте внешний слой 4-0 нейлоновым швом. Дезинфицировать хирургическое место с повидон-йод и 70% этанола. Разрешить мыши, чтобы восстановить под инфракрасным облучением 10-15 мин. Монитор мыши, пока он не приходит в сознание и подвижность. На следующий день после операции проверьте общее состояние мыши и анастомотическую утечку. Вводят кетопрофен (5 мг/кг) один раз в день в течение 3 дней после операции и лечить энрофлоксацин (5 мг/кг) один раз в день в течение 10 дней после операции. Когда место разреза зажило (10-14 дней после операции), удалите швы. Мониторинг роста опухоли мочевого пузыря мыши в течение 2-3 недель после инъекции опухолевого органоида. Если рост опухоли мочевого пузыря наблюдается, эвтаназии мыши с помощью вдыхания углекислого газа, и урожай всей опухоли мочевого пузыря. Вымойте его с помощью холодных DPBS(Рисунок 3B)16. Для анализа гистологии опухоли мочевого пузыря, пятно парафин-встроенный раздел ткани с помощью гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания(рисунок 3B)16.