JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

A السل الجزيئي ة الحمل البكتيري ة (TB-MBLA)

Published: April 30, 2020
doi:
10.3791/60460
, , , , , , , ,
1Division of Infection and Global Health, School of Medicine,University of St Andrews, 2National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, 3Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, 4Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences,University of Glasgow

Summary

نحن نصف اختبار فحص الحمل البكتيري الجزيئي السل أجريت بعد تنشيط الحرارة من البلغم. تعطيل الحرارة يجعل عينات البلغم غير معدية ويغني الحاجة إلى مختبرات الاحتواء من المستوى 3 للاختبارات الجزيئية للسل.

Abstract

السل سببه السل الميكوباكتري (Mtb)، وهو ممرض تصنفه الأمم المتحدة كمادة بيولوجية خطيرة من الفئة باء. من أجل سلامة العمال ، يجب أن يتم التعامل مع جميع العينات المفترض أنها تحمل Mtb في مختبر مستوى الاحتواء (CL) 3. اختبار قياس الحمل البكتيري الجزيئي للسل (TB-MBLA) هو اختبار تفاعل سلسلة بوليميراز كمي عكسي (RT-qPCR) يحدد كمية الحمل العصوية Mtb باستخدام المبشرات والمسابير ذات العلامات المزدوجة لـ 16S rRNA. نحن نصف استخدام تعطيل الحرارة لجعل عينات السل غير معدية مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي للسل-MBLA. يتم غلي 1 مل العلية من عينة البلغم في أنابيب الطرد المركزي مغلقة بإحكام 15 مل لمدة 20 دقيقة إما في 80 درجة مئوية، 85 درجة مئوية، أو 95 درجة مئوية لتعطيل عصية Mtb. وأكدت زراعة عينات الحرارة المعطلة والخاضعة للرقابة (الحية) لمدة 42 يوماً وفاة السل. ثم يتم ارتفاع العينة المعطلة مع 100 ميكرولتر من التحكم في الاستخراج ويتم استخراج الحمض النووي الريبي بعد إجراء عزل الحمض النووي الريبي القياسي. ولم يلاحظ أي نمو في ثقافات العينات المعالجة بالحرارة. يخضع الحمض النووي الريبي المعزول لـ RT-qPCR في الوقت الحقيقي ، مما يضخم هدفًا محددًا في جين Mtb 16S rRNA ، مما يؤدي إلى نتائج في شكل دورات قياس كمي (Cq). يتم استخدام منحنى قياسي لترجمة Cq إلى حمل بكتيري ، أو وحدات تشكيل مستعمرة تقديرية لكل مل (eCFU / mL). هناك علاقة عكسية بين Cq والحمولة البكتيرية للعينة. القيد هو أن تعطيل الحرارة يتساقط على بعض الخلايا ، مما يعرض الحمض النووي الريبي لRNases التي تسبب خسارة < 1 سجل10eCFU / مل (أي ، < 10 CFU / مل). ستحدد دراسات أخرى نسبة المرضى الذين يعانون من عبء منخفض للغاية الذين يتسببون في نتائج سلبية كاذبة بسبب تعطيل الحرارة.

Introduction

بسبب السل الميكوباكتري (Mtb)، أكثر من 7 × 106 حالات جديدة من السل (السل) يتم الإبلاغ عنها على الصعيد العالمي منها أكثر من 1 × 106 يموت في السنة1،,2. ولعكس هذا الاتجاه، أطلقت منظمة الصحة العالمية نهجاً ثلاثي الأركان يشمل تطوير أدوات تشخيص وعلاج فعالة3. وتصنف الأمم المتحدة مادة بيولوجية خطيرة من نوع B، ويتطلب العمل مع عينات يفترض أنها إيجابية بالنسبة لمادة Mtb مستوى احتواء قدره 3. مختبرات CL3 مكلفة لبناء وصيانة. ونتيجة لذلك، فإن معظم البلدان لديها خدمات مركزية لثقافة السل على الصعيدين الإقليمي أو الوطني. وهذا يعني أن المجهر اللطاخة هو الأداة التشخيصية الأكثر توفرًا في مرافق الرعاية الصحية الطرفية.

هناك موافقة منظمة الصحة العالمية على تنفيذ الاختبارات الجزيئية السريعة مثل Xpert MTB/RIF في مرافق الرعاية الصحية من المستوى 4، وتقع في الغالب على مستويات المقاطعات4،5. بعض المناطق كبيرة جدا وأقل سهولة في الوصول إليها لبعض الناس. على الرغم من أنه مفيد ، يعمل Xpert MTB / RIF عن طريق الكشف عن الحمض النووي Mtb. الحمض النووي هو جزيء مستقر يبقى لفترة طويلة بعد وفاة الخلايا وبالتالي ليس معيارًا جيدًا لقياس الخلايا القابلة للحياة الحرجة لمراقبة استجابة العلاج5،6. تقدم المقالات المستندة إلى الحمض النووي الريبي بديلاً للقياس الدقيق للخلايا القابلة للحياة7،8،9،10،11،12،13. الحمض النووي الريبي موجود في أنواع مختلفة من الاستقرار متفاوتة: الحمض النووي الريبي (rRNA)، نقل الحمض النووي الريبي (رنا)، ورسول الحمض النووي الريبي (مرنا). ويرتبط رسول الجيش الملكي النيبالي مع التعبير الجيني، وبالتالي الأكثر ارتباطا وثيق مع نشاط الخلية وقابلية البقاء14. من المهم ملاحظة أن غياب التعبير الجيني لا يعادل موت الخلايا لأن مسببات الأمراض مثل Mtb معروفة بوجودها في الدول الخاملة (نائمة) ولكنها قابلة للحياة15،16. الأنواع المستقرة الحمض النووي الريبي مثل rRNA هي علامات أفضل لكل من الحالات النشطة وغير النشطة من الخلايا القابلة للحياة.

باستخدام الإشريكية القولونية، شيريدان أظهرت أن 16S rRNA زيادة نسبيا مع النمو البكتيري تقاس وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) التهم17. كان هناك انخفاض متزامن في عدد CFU و 16S rRNA عندما تعرضت بكتيريا الإشريكية القولونية للمضادات الحيوية. كان الانخفاض في rRNA بعد موت الخلية مؤشرا على أنه يمكن استخدامه كعلامة لصلاحية الخلية13،17. وبالاعتماد على هذا المبدأ، تم تطوير قياس الحمل البكتيري الجزيئي للسل (TB-MBLA) لاستهداف M. Tuberculosis 16S rRNA لقياس الحمل عصيات السل القابل للتطبيق كعلامة على استجابة العلاج للمرضى على العلاج المضاد للسل11,18,19. لقد قمنا بتطوير وتحسين السل MBLA لدمج التحكم في الاستخراج الخلوي الذي يعكس الانسالة من عصيات السل M. وقوية في بيئات بيئية مختلفة20. يتطلب إجراء TB-MBLA الخطوات الأولى لعزل الحمض النووي الريبي من Mtb ليتم إجراؤها في مختبر CL3 حتى يتم تحل خلايا Mtb بالكامل لضمان سلامة العمال. ويشمل أيضا الحفاظ على عينة للتحليل دفعات بأثر رجعي ليتم الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية في الثيوكيات guanidine، مادة سامة من المستوى 4. ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا الحرارة لتعطيل Mtb وجعل العينات آمنة لTB-MBLA ليتم إجراؤها في مختبرات مستوى التنظير المجهري.

استخدام الحرارة في التطبيقات المختبرية والسريرية وقد حول ها منذ قرون21،22. ومع ذلك ، فإن بعض الكائنات الحية الدقيقة مثل Mtb صعبة القتل ، والتعرض لأقصر للحرارة غير كافية لقتل جميع الخلايا23،24. كشفت دراسة أن 20 دقيقة تسخين ثقافات السل في 80 درجة مئوية قتل جميع عصيات Mtb دون تدمير الحمض النووي اللازم لPCR25. وفي وقت لاحق، فإن عددا من تقنيات استخراج الحمض النووي المختبري ة الحرارة حاليا إلى 95 درجة مئوية. لقد طبقنا نفس المبدأ لإظهار أن عينات السل المغلي إما عند 80 درجة مئوية أو 85 درجة مئوية أو 95 درجة مئوية يعطل Mtb مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي الكافي للسل-MBLA ليتم إجراؤها. يمكن الحفاظ على الثقافة أو البلغم المعطلة في حاويات مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة أو تبريدها لمدة 7 أيام دون تقليل كمية rRNA القابلة للقياس الكمي.

اختبار TB-MBLA، المستخدم حاليًا كاختبار استخدام بحثي فقط (RUO) قابل للتكيف وتم تطبيقه على أنواع مختلفة من العينات بما في ذلك البلغم وأنسجة الرئة والسائل الشوكي الدماغي. لم يتم تطبيقه بعد على السائل الهوائية الهوائية والدم وأنواع العينة الأخرى. باستخدام البلغم كعينة ، نتائج التقييم متعدد المواقع في أفريقيا (البيانات غير المنشورة) والمنشورات السابقة18،26 تظهر أن حساسية MBLA تتفق مع أنبوب مؤشر النمو الميكوباكتيري (MGIT) الثقافة السائلة. ومع ذلك، فإن السل-MBLA أسرع، ويعطي نتائج في ساعات بدلاً من أيام أو أسابيع من الثقافة، محددة، لا تتأثر بالكائنات الحية الدقيقة غير السل ية في العينة، ويعطي مقياساً كمياً لشدة المرض. وقد اعترفت منظمة الصحة العالمية مؤخراً بالسل -MBLA كمرشح ة لاستبدال المجهر الضوئي اللطاخة والثقافة لرصد علاج السل2.

في هذه المقالة نصف بالتفصيل تنشيط الحرارة وبروتوكول TB-MBLA المنشورة في سابيتى وآخرين27. سيوفر هذا البروتوكول التفصيلي موردًا مرئيًا شاملًا لمستخدمي TB-MBLA في جميع أنحاء العالم.

Protocol

1. إعداد العينة الثقافه العمل على مقاعد البدلاء نظيفة أو فئة 1 المقصورة، حصاد 1 مل aliquots من المرحلة الأسية عصيات كالميت غيرين (BCG) الثقافة في 15 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية. إغلاق بإحكام الأنابيب.ملاحظة: لمعالجة عينة كاملة من 5 مل، هناك حاجة إلى خمسة أنابيب طرد مركزي 15 مل.تنبيه:مطلوب مجلس وزراء السلامة البيولوجية عند العمل مع أي ثقافة السل. عينة من البلغم المريض العمل في مساحة جيدة التهوية وارتداء قناع الأنف، وفتح بعناية كوب العينة، pipette 1 مل aliquots في أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية 15 مل وإغلاق بإحكام الأنابيب.ملاحظة: يوصى بطرف فم واسع لـ ماصة البلغم. باستخدام زوج من مقص، مقطع قبالة الجزء الدقيق من الفم تلميح 1 مل لخلق فم أوسع. 2. تنشيط الحرارة قبل إعداد العينة، قم بتعيين حمام الماء إلى 95 درجة مئوية.ملاحظة: تزيد درجة حرارة 95 درجة مئوية من فرصة تقليل نشاط RNase وبالتالي الحفاظ على المزيد من الحمض النووي الريبي للسل المصب-MBLA. نقل أنابيب العينة إلى رف عقد مغمورة في حمام الماء. تأكد من غمر ثلاثة أرباع كل أنبوب عينة في الماء. يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم نقل الأنابيب إلى مقاعد البدلاء لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة قبل البدء في استخراج الحمض النووي الريبي.ملاحظة: تم التحقق من التعطيل الحراري الكامل لعصيات السل M. و BCG من خلال احتضان عينات وضوابط منشطة للحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 42 يومًا للتحقق من النمو. تم أخذ قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600)عند خط الأساس ثم أسبوعيًا لفترة الحضانة لمدة 42 يومًا. 3. استخراج الحمض النووي الريبي ملاحظة: عملية استخراج الحمض النووي الريبي الموصوفة هنا هي لمجموعة الحمض النووي الريبي المدرجة في جدول المواد. ويمكن استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي مناسبة أخرى من قبل الشركات المصنعة المختلفة. إضافة التحكم في الاستخراج (EC) نقل 1 مل aliquots من عينات الحرارة تعطيل إلى أنابيب 1.5 مل. سبايك 100 ميكرولتر من EC في كل عينة، وإغلاق الأنبوب، وتخلط عن طريق عكس الأنبوب رأسا على عقب 3x.ملاحظة: يتم تزويد المفوضية الأوروبية مع مجموعة البكتيريا الحيوية السل-MBLA(جدول المواد). ترسيب الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء، طرد مركزي الأنابيب في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة قبالة supernatant، وترك 50 ميكرولتر من الرواسب. تعليق الرواسب في 950 μL من العازلة اللايس عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، ونقل التعليق كله في أنبوب مصفوفة التليس الموردة مع عدة استخراج الحمض النووي الريبي(جدول المواد). تأكد من إغلاق الأنابيب بإحكام وتسمية كل من غطاء وجانب الأنبوب. لخلية التليس، نقل الأنابيب من الخطوة 3.2.2 إلى المتجانس. تجانس العينات لمدة 40 s في 6000 دورة في الدقيقة. تنقية الحمض النووي الطرد المركزي lysate من الخطوة 3.3 في 12،000 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إعداد أنابيب جديدة 1 مل وإضافة 300 ميكرولتر من الكلوروفورم في كل أنبوب. باستخدام 1 مل تلميح بعناية ماصة قبالة supernatant دون لمس مصفوفة التليس. نقل supernatant إلى الكلوروفورم التي تحتوي على أنابيب ودوامة لمدة 5 ق. ترك الأنبوب لتسوية لمدة 5 دقيقة أو أكثر حتى ثلاث مراحل (العلوي والأوسط والسفلي) مرئية بوضوح. الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة بعناية المرحلة العليا ونقلها إلى أنابيب 1.5 مل جديدة. إلى الأنابيب في الخطوة 3.4.5، إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول الجليد الباردة 100٪، وإغلاق الأنابيب، وتخلط بلطف عن طريق عكس رأسا على عقب 3x. احتضان الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ومواصلة استخراج، أو ترك في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لإكمال استخراج في اليوم التالي. تعيين الطرد المركزي الدقيق إلى 4 درجات مئوية وترك لتبرد إلى ما لا يقل عن 12 درجة مئوية قبل البدء في الطرد المركزي. قم بتحميل الأنابيب في جهاز الطرد المركزي الدقيق والطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 13000 × ز. تخلص من الفوقناتان، واستبدل بالإيثانول البارد بنسبة 70٪، والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة أخرى عند 13000 × ز.ملاحظة: وينبغي إجراء الإيثانول 70٪ مع المياه الخالية من النواة من الدرجة الجزيئية. تخلص من جميع supernatant من الخطوة 3.4.7 ونقل الأنابيب إلى حاضنة تعيين في 50 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة لتجفيف الحمض النووي الريبي / الحمض النووي بيليه. إبقاء أنابيب مفتوحة جزئيا لتمكين تبخر جميع الإيثانول. إضافة 100 ميكرولتر من الماء المجاني nuclease إلى بيليه الجافة واحتضان لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. دوامة لمدة 3 s لخلط المحتويات.ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن تخزين المقتطف 2-3 أيام في الثلاجة أو لفترة أطول عند -80 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ القسم 3.5. إزالة الحمض النوويملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأن وجود الحمض النووي في استخراج يبطل نتيجة MBLA. ويستند هذا القسم على مجموعة إزالة الحمض النووي(جدول المواد). إعداد مزيج من إنزيم DNase I 10x المخزن المؤقت وDNase I إنزيم لعدد من العينات (10 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 1 μL من DNase لكل عينة) بالإضافة إلى 10٪ إضافية لتغطية أي خسارة من الأنابيب. مزيج عن طريق الدوامة ومن ثم ماصة 11 μL في كل أنبوب يحتوي على استخراج الحمض النووي الريبي. مزيج عن طريق دوامة 3 ق ثم تدور لفترة وجيزة (10 ق في 13،000 × ز) لإزالة أي قطرات على الجدران. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة ساخنة أو حاضنة. إضافة 1 μL إضافية من إنزيم DNase I مباشرة في كل أنبوب، وتخلط جيدا عن طريق الدوامة، واحتضان لمدة 30 دقيقة أخرى في 37 درجة مئوية. إذاث كاشف تعطيل DNase 10 دقيقة قبل نهاية حضانة DNase. دوامة 20 ق لضمان متجانسة، تعليق حليبي ومن ثم إضافة 10 ميكرولتر من كاشف تعطيل DNase في كل استخراج الحمض النووي الريبي من الخطوة 3.5.2. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. Vortex 3x خلال خطوة الحضانة 5 دقيقة. طرد مركزي الخليط في 13،000 × ز لمدة 2 دقيقة. نقل بعناية supernatant إلى 1.5 مل RNase أنابيب خالية دون لمس أي من مصفوفة التعطيل. تخزين استخراج الحمض النووي الريبي في الثلاجة إذا كان تشغيل RT-qPCR في نفس اليوم أو في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. 4. عكس Transcriptase qPCR للحصول على عينات غير معروفة، تمييع جميع مستخلصات الحمض النووي الريبي لاستخدامها في نسبة 1:10 في المياه الحرة RNase. مزيج جيدا عن طريق الدوامة لمدة 5 ق وتدور لفترة وجيزة إلى أسفل لإزالة أي قطرات أو فقاعات الهواء. للحصول على عينات قياسية لمنحنى قياسي، خذ معايير Mtb و EC RNA من الفريزر -80 درجة مئوية وذوبان في درجة حرارة الغرفة. جعل سبعة وستة 10 أضعاف تخفيف من Mtb وEC عينات قياسية على التوالي. تغيير النصائح قبل نقل الخليط من أنبوب واحد إلى آخر.ملاحظة: يتم توفير عينات قياسية مع مجموعة TB-MBLA. إعداد مزيج رئيسيملاحظة: المزيج الرئيسي (MM) هو حل من كواشف PCR كافية لتضخيم جميع العينات والمعايير والمياه للتحكم في أي قالب (NTC). يجب أن تكون المياه المستخدمة كNTC نفس المياه المستخدمة في الاستخراج ولإعداد MM. تأكد من أن المعايير ، كل عينة الحمض النووي الريبي ، والتخفيف العشري لها يتم تضخيمها 2x لرد الفعل الإيجابي النسخة العكسية (RT +) و 1x لرد الفعل السلبي للنسخ العكسي (RT-) . رد فعل RT هو عنصر تحكم لتحديد كفاءة إزالة الحمض النووي(الجدول 1). نقل 16 ميكرولتر من MM إلى كل أنبوب تفاعل PCR. أضف 4 ميكرولتر من مستخلص الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب رد فعل RT+ و RT-water في أنابيب تفاعل NTC. تحميل أنابيب التفاعل في آلة PCR في الوقت الحقيقي وتعيين شروط PCR على النحو التالي: 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، دورات 40x في 94 درجة مئوية لمدة 45 ق، و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة مع اقتناء مع الفلوروبورورس التي تمتص في القنوات الخضراء والصفراء.ملاحظة: القناة الخضراء هي مtb الكشف عن fluorophore والأصفر هو الفلوروفور الكشف عن الاستخراج. تفسير النتائجملاحظة: تأكد من أن ردود الفعل المكررة من نفس العينة لا تختلف بأكثر من انحراف معياري واحد. وتعتبر قيم Mtb وEC Cq أعلى من 30 قيم سلبية. انظر المزيد من تفاصيل التفسير في الجدول 2. لتفسير استجابة العلاج، قم بتحويل قيم Cq إلى حمل بكتيري (eCFU/mL) باستخدام المنحنى القياسي. قراءة استجابة العلاج كتغيير في الحمل البكتيري خلال فترة متابعة العلاج.ملاحظة: ويدل انخفاض الحمل البكتيري بعد العلاج على استجابة إيجابية (أي الأدوية المضادة للسل التي تقتل بكتيريا السل) في حين أن أي تغيير أو ارتفاع في الحمل البكتيري ينطوي على استجابة سلبية، مما قد يعني مقاومة بكتيريا السل للأدوية المضادة للسل أو عدم التزام المريض بشكل مناسب بجرعة العلاج الخاصة به. ويرتبط انخفاض الحمل البكتيري الذي يقاس بالسل-MBLA مع زيادة الوقت MGIT إلى الإيجابية الثقافة (TTP). 5. انتقال المجهر الإلكترون نقل 2 مل aliquots من الثقافات المعطلة الحرارة والضوابط في 2 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مل. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقيقة بسعر 20,000 × ز. تجاهل supernatant وتعليق بيليه في 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت تثبيت الخلية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة لإصلاح الخلايا. الطرد المركزي تعليق لمدة 30 دقيقة في 16،000 × ز للحصول على بيليه الثابت. تجاهل supernatant واستبدال مع 1٪ السكروز في الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS). تخزين الكريات في السكروز في 4 درجة مئوية حتى تشريح المجهر الإلكترون. أقسام وTEMملاحظة: تم تكييف البروتوكول أدناه من غريفيث وآخرون28. Cryoprotect بيليه الخلية عن طريق تضمينها في 2.1 M السكروز في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 °C. اغسل 3x بالماء البارد. تبريد كريات الخلايا المحمية بالتبريد في النيتروجين السائل وتركيبه كعوب الكعوب. باستخدام cryomicrotome، وقطع أقسام رقيقة في 90 نانومتر. استرداد أقسام قطع باستخدام حلقات سلك التنغستن من 1:1 خليط من 2٪ من السليلوز الميثيل و 2.1 M السكروز في برنامج تلفزيوني. نقل المقاطع إلى pioloform المغلفة 150 شبكة النحاس سداسية TEM يدعم (الشبكات) وتخزينها في 4 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة 5.4.5. على النقيض من الشبكات في خلات uranyl والهواء الجاف في فيلم خلات الميثيل. غسل الشبكات بالماء البارد الجليدي متبوعاً بقطرتين من برنامج تلفزيوني على مدى 5 دقيقة وجاف لمدة 15-30 دقيقة.ملاحظة: تم تنفيذ جميع خطوات وضع العلامات في درجة حرارة الجليد (درجة حرارة السائل) باستثناء خطوات الغسيل ، والتي تم إجراؤها في درجة الحرارة المحيطة.

Representative Results

الحرارة يعطل جميع M. السل عصياتزادت الكثافة البصرية (OD) لعناصر التحكم (الخلايا الحية) بمرور الوقت ، (0.04OD- 0.85OD)ولم يلاحظ أي تغيير في OD في العينات المعطلة للحرارة ، مما يدل على النمو وعدم النمو على التوالي(الشكل 1)27. وبالمثل ، نمت السيطرة البلغم السريري إيجابية بحلول اليوم 3 في MGIT في حين أن العينات السريرية المعطلة للحرارة لم تكن علامة إيجابية حتى نهاية الحضانة. وقد أكد نمو Mtb في MGIT من قبل زيل-Neelsen مسحة المجهر ومستضد MPT6429. الحمض النووي الريبي في عينات معطلة مستقرة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيامتم احتضان عينات منشطة الحرارة عند 37 درجة مئوية لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي يتحلل بعد تعطيل الحرارة للخلايا. لم يتم العثور على أي فرق بين الحمض النووي الريبي الذي تم حصاده في اليوم (D) 0 مباشرة بعد تعطيل الحرارة والحمض النووي الريبي المعزول في D1 و 2 و 3 و 4 في كل من ثقافات BCG(الشكل 2A-C)والبلغم الإيجابي والسل(الشكل 2D). RNase الخارجية يزيد من معدل تدهور الحمض النووي الريبي في الكسور المعطلة للحرارةلتحديد سبب عدم تحلل الحمض النووي الريبي، تمت إضافة إنزيم RNase A خارجيًا عند 1000 U/mL قبل و/أو بعد تعطيل الحرارة. تسبب هذا في فقدان الحمض النووي الريبي ما يعادل الحمل البكتيري 1.5 ± 0.3 -، 1.8 ± 0.2 -، و 1.3 ± 0.1 – سجل10 eCFU/mL عند 80 درجة مئوية، 85 درجة مئوية، و 95 درجة مئوية على التوالي عبر 4 أيام من الحضانة. كان هناك فرق في الحمض النووي الريبي المتدهور ة في العينات حيث تمت إضافة RNase قبل و / أو بعد تعطيل الحرارة(الشكل 3A-C). يتم الحفاظ على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لTB-MBLA باستخدام 16S rRNA كعلامة مرجعيةتم قياس تأثير تعطيل الحرارة على rRNA في ثقافات BCG والبلغم من المرضى المصابين بالسل إيجابية. الحمل البكتيري المقاس لثقافة التحكم BCG، 5.3 ± 0.2 سجل10 eCFU/mL، كان 0.2 ± 0.1 سجل10 eCFU/mL أعلى من مجتمعة 5.1 ± 0.3 سجل10 eCFU/mL من الحرارة المعطلة الثقافة (ANOVA p < 0.0001) في 80 درجة مئوية، 85 درجة مئوية، و 95 درجة مئوية(الشكل 4A)27. وبالمثل، كان الحمل البكتيري من البلغم المريض السيطرة، 7.1 سجل10 eCFU/mL، 0.8 ± 0.1 سجل10 eCFU/mL أعلى من مجتمعة 6.3 ± 0.41 سجل10eCFU/mL في 80 درجة مئوية، 85 درجة مئوية، و 95 درجة مئوية(الشكل 4B)27. وكان تخفيض الحمل البكتيري < 1log في نوعين من العينات التي تم اختبارها. كشف اختبار مقارنات سيداك المتعددة عن فرق كبير بين الحمل البكتيري عند 95 درجة مئوية مقابل 80 درجة مئوية و85 درجة مئوية (p = 0.001). ولم يُعثر على أي فرق في عينات السل في جميع درجات الحرارة، ص = 0.8. لا يتم تدمير سلامة جدار الخلية بسبب الحرارة في غالبية خلايا Mtbباستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM) تحققنا ما إذا كانت الخلايا قد تم تحل بسبب تعطيل الحرارة. تم إجراء أجزاء رقيقة من الكريات الثابتة بارافورمالديهايد من الخلايا وجزءا لا يتجزأ من وسيلة غنية الإلكترون قبل الفحص من قبل TEM. كشف فحص الخلايا في التكبير السفلي والعالي جدار الخلايا السليم والأجسام المرئية داخل الخلايا. ظهرت الخلايا بشكل مورفولوجي ممدود ولكن ليس مبلأ. يوضح الشكل 5 مورفولوجيا خلايا المتفطرة في تكبيرات مختلفة. أعلى اثنين من لوحات تكشف الهيئات الدهون داخل الخلايا والحبال الحبل غير العوائق مثل حبل, سمة مورفولوجية نموذجية من الأنواع الميكوباكترية. أقل اثنين من لوحات هي أعلى التكبير توسيع وجهة نظر الهيئات الدهنية والكشف عن بعض الهياكل الصغيرة داخل الخلايا. يرتبط الحمل البكتيري الذي يقاس بTB-MBLA ارتباطًا عكسيًا بوقت ثقافة MGIT بالإيجابيةبالنسبة للمرضى الذين يستجيبون للعلاج ، ينخفض الحمل البكتيري بمعدل 1 سجل10 eCFU / mL في الأسبوع على مدار العلاج. المستجيبين بسرعة واضحة أسرع، وتحويل إلى سلبي (صفر الحمل البكتيري) من قبل 2 أسابيع من العلاج. وتطابق الانخفاض في الحمل البكتيري الذي يقاس بالسل -MBLA مع ارتفاع وقت ثقافة MGIT إلى الإيجابية (TTP). يوضح الشكل 6 الارتباط العكسي الموجود بين الحمل البكتيري وMGIT TTP. ومع ذلك، فإن الفرق هو أن نتائج TB-MBLA متوفرة في 4 ساعة والوقت إلى النتيجة مستقل عن مستوى الحمل البكتيري. هذا على النقيض من 5-25 يوما لاختبارات ثقافة MGIT. كما أن التلوث بالبكتيريا غير السلية يزيد من تقويض نتائج اختبارات الثقافة. الشكل 1: التحقق من تعطيل BCG عند 80 درجة مئوية (منحنى نمط النقطة)، 85 درجة مئوية (منحنى نمط نقطة اندفاعة)، و 95 درجة مئوية (منحنى نمط شرطة). وكان التحكم (منحنى أسود) يعيش (غير مدفأة) BCG الثقافة تطعيم في نفس المتوسط النمو. وقد تأكد نمو السيطرة من خلال زيادة OD من الثقافة خلال فترة الحضانة. تم تعديل هذا الرقم من سابيتى وآخرين27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: استقرار الحمض النووي الريبي القابل للقياس الكمي في عينة منشطة حرارياً مُضاجة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام (D0-D4). (أ)و(ب)و(C)تظهر ثقافات BCG غير المعطلة عند 80 درجة مئوية و85 درجة مئوية و95 درجة مئوية على التوالي. (D)يظهر البلغم السل تنشيط في 80 درجة مئوية. عنصر التحكم هو الكسر (المباشر) غير المعالج لنفس العينة. أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري. ثلاثة يكرر، تسعة يكرر لكل شوط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: ارتفاع تدهور الحمض النووي الريبي بعد إضافة خارجية من إنزيم RNase A. (أ)تنشيط الحرارة (مرحبا) في 80 درجة مئوية،(ب)مرحبا في 85 درجة مئوية، و(C)مرحبا 95 درجة مئوية. أشرطة الخطأ = الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الحفاظ على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لقياس الحمل البكتيري TB-MBLA باستخدام 16S rRNA كعلامة. (أ)الحمل البكتيري المقدر من الثقافات BCG في المختبر. (ب)الحمل البكتيري المقدر من البلغم الإيجابي للسل. أشرطة الخطأ = الخطأ القياسي للمتوسط (n = 18 و 20 ينسخ لA و B على التوالي). تم تعديل هذا الرقم من سابيتى وآخرين27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: ميكروجرافات إلكترونية لعصيات Mtb سليمة بعد تعطيل عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم ملاحظة جدار الخلية السليمة واضحة وأجسام الدهون تعداد مع TEM. أعلى: صور التكبير منخفضة لمجموعة من الخلايا تكشف عن غير يعوق النخاع يبكّر حبل مثل مورفولوجيا الحبل والأجسام الدهنية داخل الخلايا. أسفل: التكبير عالية من الألواح العليا لتوسيع وجهة نظر الهيئات الدهون والكشف عن بعض الهياكل الصغيرة داخل الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: منحنى استجابة العلاج لمدة 12 أسبوعًا للمريض في العلاج المضاد للسل الذي يظهر ارتباطًا عكسيًا للحمولة البكتيرية المقاسة من السل-MBLA وMGIT TTP. ينخفض الحمل البكتيري (المنحنى الأزرق) بينما يرتفع TTP (منحنى أحمر) مع استجابة المريض للعلاج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مزيج رئيسي رد فعل إيجابي RT رد فعل سلبي RT حجم لكل رد فعل x لا. من ردود الفعل + 5 حجم لكل رد فعل x لا. من ردود الفعل + 5 مزيج الكمية 10.0 ميكرولتر 10.0 ميكرولتر مزيج التمهيدي Mtb16S (F + R) 0.4 ميكرولتر 0.4 ميكرولتر Mtb16S التحقيق 0.2 ميكرولتر 0.2 ميكرولتر مزيج التمهيدي EC (F + R) 0.4 ميكرولتر 0.4 ميكرولتر التحقيق المفوضية الأوروبية 0.2 ميكرولتر 0.2 ميكرولتر إنزيم RT 0.2 ميكرولتر ——- RNase المياه الحرة 4.6 ميكرولتر 4.8 ميكرولتر إجمالي الحجم 16 ميكرولتر 16 ميكرولتر الجدول 1: دليل إعداد المزيج الرئيسي لـ TB-MBLA qPCR. نوع قناة MTB قناة المفوضية الأوروبية تفسير عينه ايجابيه ايجابيه صالح عينه ايجابيه السلبيه معرفه عينه السلبيه ايجابيه صالح عينه السلبيه السلبيه غير صالح MTB + التحكم ايجابيه السلبيه صالح التحكم في الاستخراج (EC) السلبيه ايجابيه صالح التحكم في الحمض النووي السلبيه السلبيه صالح التحكم السلبي (NTC) السلبيه السلبيه صالح الجدول 2: دليل تفسير نتائج TB-MBLA.

Discussion

وتبين هذه المقالة أن المعالجة الحرارية لمدة 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية و85 درجة مئوية و95 درجة مئوية يعطل عينات السل بشكل فعال، مما يجعل من الممكن تنفيذ السل-MBLA في منشأة غير CL3 دون خطر العدوى للعاملين في المختبر. وتؤكد النتائج الملاحظات التي أبديت في دراسات سابقة بينما تتناقض مع بعض حول فعالية تنشيط الحرارة من Mtb25,30. على سبيل المثال، تشير بعض التقارير إلى أن التدفئة عند 80 درجة مئوية ليست فعالة على عينات الحمل العصوية العالية25،31،32،33. تم تجنب تأثير التلقيح عالي الكثافة في دراستنا من خلال ضمان تسخين جميع البلغم والثقافات النقية بحجم 1 مل لكل أنبوب طرد مركزي 15 مل مما يوفر مساحة كافية لتعريض كل جزء من العينة للغليان27.

الحفاظ على الحمض النووي الريبي بعد تعطيل الحرارة يجعل من الممكن للسل-MBLA أن يتم تنفيذها. تتفق هذه النتيجة مع دراستين أظهرتا الحفاظ على الحمض النووي الريبي بعد تعطيل الحرارة12،34. أظهرنا أن الحمض النووي الريبي في عينات منشطة الحرارة مستقرة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام، مما يعني أن المختبرات يمكن أن دفعات الاختبارات عن طريق الحفاظ على عينات معطلة في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع. من خلال تطبيق مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التي تتطلب التبريد أو التجميد ، فإن القدرة على الحفاظ على عينات منشطة للحرارة في درجة حرارة الغرفة تغني الحاجة إلى كل من سلسلة التبريد ومختبرات الفئة 3 لأداء TB-MBLA في بيئات محدودة الموارد.

تم فقدان أقل من 1log الحمل البكتيري باستخدام rRNA 16S كعلامة. على الرغم من وجود فرق بين العينة المعطلة الحية والحرارة ، فإن الكمية المفقودة بسبب تعطيل الحرارة صغيرة جدًا بحيث لا يمكن المساس بنتائج المصب. لم تزيد درجة الحرارة المتزايدة من كمية الحمض النووي الريبي المفقودة ، مما يعني أن الخسارة الملحوظة مستقلة عن المعالجة الحرارية. المعالجة الحرارية في درجات حرارة عالية على الأرجح يسبب تحلل الخلايا، مما يعرض الحمض النووي الريبي للتدهور من قبل RNases. في الواقع، إضافة خارجية من RNase A إلى كسر تنشيط الحرارة زيادة معدل تدهور الحمض النووي الريبي. الغليان لم يقلل من نشاط RNase ، مما يعني أنه بروتين مرن للغاية.

من المهم أن نلاحظ أن متوسط تدهور الحمض النووي الريبي من 1.5 سجل10 eCFU /mL ليست خسارة كبيرة. وتحقيقا لهذه الغاية ونحن نفترض أن التدفئة يلمع نسبة صغيرة من عصيات Mtb، وبالتالي تعريض كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي لRNase. باستخدام TEM أظهرنا أن مورفولوجيا خلية Mtb وسلامة جدران الخلية لا تتأثر بالتدفئة عند 95 درجة مئوية. وهذا يعني أنه قد يتطلب عوامل فسيولوجية مختلفة وإمدادات كافية من RNases كما هو الحال في المضيف لتدهور الحمض النووي الريبي35بشكل كبير،36. وعلاوة على ذلك، يجري الريبوسم الهيكلية، 16S rRNA هو يحتمل أن تكون أقل عرضة لRNase37،38. خلية Mtb واحدة تحتوي على ~ 700 ريبوسوم/0.1 مم3 من السيتوبلازم37،مما يعني أن هناك كميات أعلى من rRNA لكل خلية. وبالتالي، كميات أصغر من RNase قد يكون لها تأثير أصغر38. ووجود أعداد كبيرة من الريبوسوم يعطي ميزة للسل -MBLA من حيث الحساسية والقدرة على الكشف عن مرضى السل منخفض العبء.

كان هناك ارتباط قوي بين الحمل البكتيري الذي يقاس بالسل MBLA وثقافة MGIT TTP. وهذا يؤكد الحمل البكتيري كمحرك للإيجابية الثقافة إلى حد ما. ومع ذلك، فإن ميزة السل-MBLA هو أنه يحدد كمية الحمل العصوية الموجودة مباشرة في العينة ولا يتطلب انتشار خلايا Mtb قبل الكشف عنها. هذا يتناقض مع الثقافة التي يعتمد وقتها للإيجابية على مستوى الحمل البكتيري ومعدل انتشار خلايا Mtb. ستقوم الدراسات المستقبلية بتقييم سير عمل TB-MBLA، بما في ذلك تعطيل الحرارة، في البيئات السريرية الروتينية. كما ستستكشف الدراسة عينات تحتوي على مجموعة من الأحمال البكتيرية لفهم العدد الذي قد يتغير من إيجابي إلى سلبي (أي أولئك الذين لديهم بكتيريا أقل بعد تعطيل الحرارة).

بروتوكول TB-MBLA للقياس الكمي الجزيئي للحمولة البكتيرية هو الأول من نوعه في علم الجراثيم. هذه الطريقة تحدد كمية مباشرة الحمل عصية Mtb من البلغم المريض ولا يتطلب أي ثقافة للقيام بذلك. وهذا يجعلها أسرع ويزيد من قدرتها على إبلاغ قرار سريري حول تقدم المريض. تقلل خطوة تعطيل الحرارة من خطر العدوى وتزيد من إمكانية تطبيق TB-MBLA في البيئات التي لا تحتوي على مختبر من الفئة 3. بعد تنشيط الحرارة للعينة ، هناك ثلاث خطوات بروتوكولية لتحقيق نتائج TB-MBLA: استخراج الحمض النووي الريبي ، والنسخ العكسي (RT) – qPCR ، وتحليل نتائج qPCR.

كلما زادت كفاءة عزل Mtb RNA من عينة المريض ، كلما زادت جودة النتائج. من المهم ملاحظة أن جودة عينة البلغم تؤثر على كمية الحمض النووي الريبي المعزول. على سبيل المثال، يعتبر البلغم اللعابي منخفض الجودة وقد ارتبط بالحمل العصوية المنخفضة. وهذا يعني أن تدريب المريض على جودة البلغم تتوقع أمر مهم. لتقييم كفاءة عملية الاستخراج ، يتم زيادة عنصر التحكم في الاستخراج (أي العدد المعروف للخلايا غير Mtb) في العينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. استرجاع التحكم استخراج يؤكد كفاءة عملية استخراج الحمض النووي الريبي. لا يمكن أن تكون عملية عزل RNA صالحة ما لم يتم استرداد عنصر التحكم في الاستخراج. وبالنظر إلى حقيقة أن Mtb هو كائن حي مرن يجعل التحليل الميكانيكي جزءًا حاسمًا من العملية. تجانس العينة بسرعة عالية (600 دورة في الدقيقة) في وجود الخرز (أي مصفوفة التسييل) يلهي الخلايا بشكل فعال. تنقية الليسات ينتج استخراج يحتوي على كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي. إزالة الحمض النووي هو خطوة حاسمة الأخيرة من استخراج الحمض النووي الريبي. يهدف TB-MBLA إلى قياس عصيات قابلة للتطبيق من خلال تحديد الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، فإن الفشل في إزالة الحمض النووي الجينومي يعني أن النتائج سيكون لها إشارة من الحمض النووي ، وهو ليس علامة جيدة لصلاحية الخلية6.

وRT-qPCR هو مزدوج تشغيل تحقيقات مزدوجة وصفت لMtb والسيطرة على الاستخراج. وهو ينطوي على ثلاث خطوات: 30 دقيقة النسخ العكسي عن طريق transcriptase العكسي في 50 درجة مئوية، 15 denaturation دقيقة عند 95 درجة مئوية، و 40 دورات من التضخيم في 94 درجة مئوية و 60 درجة مئوية. ويحدث اكتساب الفلورسينس من المسابير عند 60 درجة مئوية (أي مرحلة استطالة الأجزاء). من المهم ملاحظة أنه تم تحسين TB-MBLA باستخدام جهاز qPCR معين ، لذلك يجب على المشغلين الذين يستخدمون منصات qPCR الأخرى تحسين ظروف معداتهم. يتم التحكم في كفاءة إزالة الحمض النووي من خلال تشغيل رد فعل واحد لكل عينة في حالة عدم وجود RT. نتيجة إيجابية من رد الفعل هذا يعني إزالة غير مكتملة من الحمض النووي. عينات العبء العالي التي تحتوي على كميات عالية من الحمض النووي قد تتطلب ضعف كمية إنزيم DNase لإزالة الحمض النووي تمامًا. لحسن الحظ، في عينات الحمل العُملية العالية، وجود كميات صغيرة من الحمض النووي أقل احتمالاً للتأثير على النتيجة من الحمض النووي الريبي. الريبوبال الجيش الملكي النيبالي، هدف السل-MBLA، يحدث بشكل طبيعي في ضعف كمية الحمض النووي37. في PCR ، لا يوجد عنصر تحكم في القالب (NTC) ، وهو الماء المستخدم لحل كواشف PCR ، وضوابط للتلوث عبر الحمض النووي الخارجي أو الحمض النووي الريبي. إشارة إيجابية في المجلس الوطني الانتقالي يعني التلوث عبر والنتيجة تعتبر غير صالحة. وهذا يعني أن جميع الحلول التي يتم تشكيلها باستخدام هذه المياه يجب التخلص منها والحلول الجديدة باستخدام قارورة عذبة من الماء. من المستحسن الحفاظ على مياه PCR في العليوت منفصلة لتجنب تلوث جميع المياه. يتم استخدام عنصر تحكم إيجابي (Mtb RNA) للتحكم في الكفاءة العامة لPCR.

تحليل النتائج ينطوي على تحويل Cqs PCR إلى الحمل البكتيري (أي وحدات تشكيل المستعمرة المقدرة لكل مل) باستخدام المنحنى القياسي. يعد وضع المنحنى القياسي وتحسينه أمرًا حاسمًا لهذه الخطوة. ويوصى بكفاءة منحنى قياسية من 0.95-1. يجب إعداد المنحنيات القياسية لـ MTb والتحكم في الاستخراج وتحسينها قبل تشغيل المرضى أو عينات الاختبار الأخرى على الجهاز. يتم توفير عينات قياسية مع مجموعة TB-MBLA. ويوصى تخفيف عشرة أضعاف من استخراج الحمض النووي الريبي لPCR. وهذا يعني أن نتيجة الحمل البكتيري يجب أن تتضاعف بعامل 10 للحصول على نتيجة الحمل البكتيري النهائي لكل مل. من المهم ملاحظة أن Cqs فوق 30 تعتبر سلبية لـ TB-MBLA. مطلوب ما لا يقل عن اثنين من نتائج الحمل البكتيري المحتملين تقاس في نقاط زمنية مختلفة لجعل الاستدلال على استجابة العلاج. ويوصى بشدة أن تكون إحدى النتيجتين خط الأساس، قبل بدء العلاج. ومع ذلك ، إذا كان المريض الذي بدأ تقييم الحمل البكتيري يحدث في منتصف الطريق من خلال العلاج ، يجب أن يكون هناك نقطة ثانية لقياس الحمل البكتيري لتقييم استجابة العلاج. يمكن أن يميز TB-MBLA الحمل البكتيري في غضون 3 أيام على العلاج ولكن المثل الأعلى هو اثنين من قياسات الحمل البكتيرية التي اتخذت 7 أيام بعيدا.

في حين أن البروتوكول يولد نتائج كمية مفيدة للاستجابة للعلاج ، فإنه لا يزال يدويًا إلى حد كبير ويتطلب يدين كبيرتين في الوقت المحدد لاستخراج الحمض النووي الريبي. قد لا يكون لدى الفنيين في المختبرات المزدحمة هذا الوقت. ويجري اتخاذ الترتيبات لأتمتة عمليات استخراج الحمض النووي الريبي وPCR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد أمكن إجراء الدراسة من خلال التمويل المقدم من شراكة التجارب السريرية الأوروبية والنامية (EDCTP) – برنامج توسيع المؤشرات البيولوجية لعموم أفريقيا (PanBIOME) منحة SP.2011.41304.008. كما تم الحصول على الدعم من منحة أبحاث كلية سانت أندروز للطب. وقد أمكن نشر هذا البروتوكول من المخطوطات وبروتوكول TB-MBLA كمورد مرئي بفضل التمويل المقدم من مجلس التمويل الاسكتلندي وصندوق بحوث التحديات العالمية إلى جامعة سانت أندروز. وبفضل مستشفى مابوتو للأمهات ومركز مافالان الصحي الذي وفر عينات البلغم السريرية، وفريق وحدة علاج السل في مابوتو الذي ساعد في تجارب تعطيل الحرارة لعينات البلغم السريرية.

Materials

Heat inactivation:
15 mL Centrifuge tubes Fisher-Scientific 10136120 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved
15 mL Wire Tube rack Fisher-Scientific 11749128 Other brands with similar make can be used
Water bath Fisher-Scientific 15700619 Other brands with similar make can be used
RNA extraction:
Chloroform Sigma 372978-1L Not necessary in other RNA extraction kit brands
Ethanol, absolute 99-100% Sigma 51976-500ML-F Larger volume available
Extraction control SOI group St Andrews VitalbacteriaEC Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit
FASTRNA Pro blue Kit MP Biomedicals 116025050 Supplied with lysing matrix tubes
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Qiagen, Fisherscientific can also supply same product
Precellys 24 homogeniser VWR 432-3750 FastPrep MP Biomedicals can be used too
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus Fisher-Scientific 15352117 Other brands with similar capacity can be used
Thermomixer Eppendorf BLD-455-010C Works with 1-2 mL tubes
TURBO DNA-free Fisher-Scientific AM1907M Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.
RT-qPCR:
Primers and Taqman probes SOI group St Andrews VitalbacteriaPP Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit Qiagen 204845 PCR mix plus the RT enzyme
RotorGene Q 5plex machine Qiagen 9001580 Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml Qiagen 981103 Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.
Non-heat inactivation Sample preservation materials
1M Tris-HCl pH 7.5 Sigma 93313 Supplied ready to use
2-Mercaptoethanol Sigma 63689 Many competent suppliers
Guanidine thiocyanate (GTC) Promega V2791 Promega brand recommended for quality
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Ensures that GTC solution is free of nucleases
General materials (used but not specific to TB-MBLA)
500 mL plastic containers 734-5087 Nalgene brand recommeded
Biological waste discard jars Many competent suppliers
Chemical waste discard jars Many competent suppliers
Disposable gloves, chemical resistant Many competent suppliers
Freezer (-20 °C) Many competent suppliers
Freezer (-80 °C) Many competent suppliers
Fridge (0-8 °C) Many competent suppliers
Fume hood For safe handling of toxic reagents
Laboratory scales For accurate measurement of reagents
Measuring cylinders, plastic To ensure accurate measurement of reagents
PCR reaction tubes Should be suitable to the PCR instrument used
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended
Qiagility loading plates Qiagen 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates
QIAgility Pipetting Robot Qiagen Important for high throughput pipetting
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes Chemical-resistant and autoclavable recommended
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) Fisher Scientific 10666421 Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme
Safety goggles, chemical resistant Fisher Scientific Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL Many competent suppliers
Sterile RNAse-free microtubes 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse Ensure it is freshly prepared or prepared within a week
Vortex Genie 2 brand recommended
Transmission electron microscopy
Glutaldehyde (8%) Sigma G7526-10ML Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
HEPES (pH 7.4, 100 mM) Sigma H4034-25G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Leica FCS ultracryo Leica Cryomicrotome for tissue sectioning
Methyl cellulose Agar Scientific AGG6425 Cold mounting resin
Paraformaldehyde (4% in PBS) Sigma P6148-500G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Sucrose Sigma 84097-250G Preservation and mounting medium
Uranyl acetate Agar Scientific AGR1260A Universal Electron microscopy stain
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
  2. World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
  3. World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
  4. Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
  5. World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
  6. Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
  7. Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
  8. Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
  9. Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
  10. Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
  11. Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
  12. Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
  13. Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
  14. Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
  15. Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
  16. Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
  17. Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
  18. Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
  19. Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
  20. Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K., Bishop, A. K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. , 89-105 (2017).
  21. Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , (2007).
  22. Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
  23. Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
  24. Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
  25. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
  26. Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
  27. Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
  28. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
  29. Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
  30. Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
  31. Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
  32. Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
  33. Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
  34. McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
  35. Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. 生物化学. 20, 2261-2267 (1981).
  36. O’Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
  37. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
  38. Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).

Tags

Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)TuberculosisDisease BurdenAnti-tuberculosis MedicationTreatment ResponseQuantitative ResultNontuberculous MycobacteriaChronic Obstructive Pulmonary DiseaseBacille Calmette-Guerin (BCG)Sputum SamplesRNA ExtractionPhenol ChloroformExtraction Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sabiiti, W., Mtafya, B., De Lima, D. A., Dombay, E., Baron, V. O., Azam, K., Oravcova, K., Sloan, D. J., Gillespie, S. H. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). J. Vis. Exp. (158), e60460, doi:10.3791/60460 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image