Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Steven E. Guard; Christopher C. Ebmeier; William M. Old

doi:10.3791/60432

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

生物化学

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Published: November 17, 2019

doi:

10.3791/60432

Steven E. Guard¹, Christopher C. Ebmeier¹, William M. Old^1,2

¹Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,University of Colorado, ²Linda Crnic Institute for Down Syndrome,University of Colorado School of Medicine

Summary

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Abstract

Immunoaffinity zuivering massaspectrometrie (IP-MS) is ontstaan als een robuuste kwantitatieve methode voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties. Deze publicatie presenteert een volledige interactie proteomica workflow ontworpen voor het identificeren van lage overvloed eiwit-eiwit interacties van de Nucleus die ook kunnen worden toegepast op andere subcellulaire compartimenten. Deze workflow omvat subcellulaire fractionering, Immunoprecipitation, monstervoorbereiding, offline opruimen, single-shot label-vrije massaspectrometrie, en downstream computationele analyse en data visualisatie. Ons protocol is geoptimaliseerd voor het opsporen van gecompartimengd, lage abundantie interacties die moeilijk te herkennen zijn aan hele celllysaten (bijv. transcriptiefactor interacties in de Nucleus) door immunoprecipatie van endogene eiwitten uit gefractioneerde subcellulaire compartimenten. De voorbeeld voorbereiding pijpleiding hier beschreven biedt gedetailleerde instructies voor de bereiding van HeLa Cell nucleair extract, immunoaffinity zuivering van endogene Bait Protein, en kwantitatieve massaspectrometrie analyse. We bespreken ook methodologische overwegingen voor het uitvoeren van grootschalige immunoprecipitatie in massaspectrometrie gebaseerde interactie profilerings experimenten en bieden richtlijnen voor het evalueren van de kwaliteit van de gegevens om te onderscheiden van echte positieve eiwitten interacties van niet-specifieke interacties. Deze aanpak wordt hier gedemonstreerd door het onderzoeken van de nucleaire interactome van de CMGC kinase, DYRK1A, een laag abundantie proteïne kinase met slecht gedefinieerde interacties binnen de Nucleus.

Introduction

Het menselijk proteoom vertoont enorme structurele en biochemische diversiteit door de vorming van stabiele multisubunit complexen en voorbijgaande eiwit-eiwit interacties. Daarom is de identificatie van interactie partners voor een eiwit van belang vaak nodig in onderzoeken om moleculaire mechanismen te ontrafelen. Recente vooruitgang in de affiniteits zuivering protocollen en de opkomst van hoge-resolutie Fast-Scanning massaspectrometrie instrumentatie hebben gezorgd voor eenvoudige mapping van eiwit interactie landschappen in een enkele onbevooroordeelde experiment.

Eiwit interactie protocollen gebruiken vaak ectopische expressie systemen met affiniteit-gelabelde fusie constructies om eiwit interacties te identificeren zonder hoogwaardige antilichamen die een eiwit van belang¹^,²herkennen. Echter, epitoop tag-gebaseerde methoden hebben verschillende nadelen. Fysieke interacties met de epitoop kunnen leiden tot de opsporing van niet-specifieke copurifying eiwitten³. Bovendien, fusie van deze epitoop Tags aan de N-of C-terminal van een eiwit kan inheemse eiwit-eiwit interacties blokkeren, of verstoren van eiwit vouwen ter bevordering van niet-fysiologische conformaties⁴. Bovendien worden in ectopische uitdrukkings systemen doorgaans het aas-eiwit in supraphysiologische concentraties overbelast, wat kan resulteren in de identificatie van artifeitelijke eiwit interacties, met name voor doserings gevoelige genen⁵. Om deze problemen te omzeilen, kan de endogene Bait proteïne worden immunoprecipitated samen met de bijbehorende interactie prooi eiwitten, uitgaande van de beschikbaarheid van een kwalitatief hoogwaardig antilichaam dat het inheemse eiwit herkent.

Hier is een interactie proteomica workflow voor het opsporen van de nucleaire interactome van een endogene eiwit met behulp van de cmgc proteïne kinase DYRK1A als voorbeeld. Verstoring van DYRK1A Kopieer nummer, activiteitsniveau of expressie kan ernstige verstandelijke handicap bij de mens veroorzaken, en embryonale letaliteit bij muizen⁶^,⁷^,⁸^,⁹. DYRK1A vertoont dynamische spatiotemporele regulering¹⁰, en gecompartimengd eiwit interacties¹¹^,¹², vereisen benaderingen die kunnen detecteren van lage abundantie interactie partners specifiek voor verschillende subcellulaire compartimenten.

Dit protocol maakt gebruik van cellulaire fractionering van menselijke HeLa-cellen in cytosol-en nucleoplasm-fracties, immunoprecipitatie, monstervoorbereiding voor massaspectrometrie en een overzicht van een bioinformatische pijpleiding voor het evalueren van de gegevenskwaliteit en het visualiseren van resultaten, met R-scripts voor analyse en visualisatie (Figuur 1). Proteomics-softwarepakketten die in deze workflow worden gebruikt, zijn allemaal vrij beschikbaar om te downloaden of kunnen worden benaderd via een webinterface. Voor aanvullende informatie over software en computer methoden zijn diepgaande tutorials en instructies beschikbaar op de aangeboden links.

Protocol

Opmerking: alle buffercomposities en protease mengsels worden beschreven in tabel 1. 1. bereiding van de cellen Opmerking: voor deze immunoprecipitatie massaspectrometrie (IP-MS) benadering is een uitgangsmateriaal van 1 − 10 mg nucleair lysaat per replicaat gewenst. Er worden celhoeveelheden gegeven voor 1 mg nucleaire immunoprecipitaties in drievloeiingen plus triplicaat-controles. Bij gebruik van een aanhandige cellijn, groeien de cellen tot 90% confluentie in 3 x 15 cm gerechten per repliceren voorafgaand aan het oogsten.Opmerking: het wordt aanbevolen om minimaal drie replicaatimmunoprecipitaties uit te voeren voor aas-en controle omstandigheden. In dit protocol wordt uitgegaan van het gebruik van ‘ kralen alleen ‘ besturingselementen, die bepalen voor overvloedige niet-specifieke interacties met de kralen, beginnend bij rubriek 4. Andere soorten besturingselementen kunnen nuttig zijn. Deze worden uitvoerig beschreven in de sectie discussie. Was de platen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsinize-cellen met 3 mL 0,25% trypsine per 15 cm plaat. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 1.200 x g en decaner de trypsine. Voor suspensie cellen, groeien tot een vergelijkbare schaal/dichtheid te bereiken 70 − 80 mg totaal eiwit. Pellet cellen bij 1.200 x g en 4 °c gedurende 5 min. decanteren de media zorgvuldig.Opmerking: pellets kunnen tijdens deze stap worden gecombineerd om efficiënte verwerking mogelijk te maken met behulp van de grootschalige subcellulaire fractionering zoals beschreven in sectie 2. Was de celpellet 2x met PBS + 5 mM MgCl2 aangevuld met proteaseremmers (pi’s) en fosfatase remmers (PhIs) (Zie tabel 1).Opmerking: Celpellets kunnen in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C worden bewaard tot ze klaar zijn voor fractionering. 2. bereiding van nucleair extract Opmerking: protease-en fosfatase remmers moeten worden toegevoegd aan de fractionering buffers binnen 30 min. gebruik. Indien bevroren, ontdooien de celpellets 15 min in 1x pellets volume van koude buffer A + Pi’s/PhIs. Plaats de celpellet op een nutator bij 4 °C om tijdens het ontdooien te helpen bij het resuspensie. Anders, respendeer de celpellet van stap 1,3 in 1x pellet volume buffer A + Pi’s/PhIs. Pellet bij 2.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. de buffer decaneren. Onderbreek de cellen met 5x het verpakte celvolume met buffer A en incuberen op ijs gedurende 20 minuten. Pellet bij 2.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. decaneren de buffer en hervatten met 2x originele verpakte celvolume buffer A + Pi’s/PhIs en dounce ~ 7X met “A”/losse stamper. Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 2.000 x g en 4 °c. Pipetteer voorzichtig de supernatant en vlam met vloeibare stikstof. Bewaar het lysaat bij-80 °c. De supernatant van deze stap is de cytosolische subcellulaire Fractie.Opmerking: de nucleaire pellet kan tijdens deze stap worden opgeslagen door Flash te bevriezen met vloeibare stikstof en op-80 °C te bewaren Rebreng de pellet met 0,9 x pellet volume van buffer B + Pi’s/PhIs en meng op een nutator gedurende 5 minuten bij 4 °C. Om de kernen te lyseren, dounce 20x met een strakkere stamper “B”. Meng het nucleaire lysaat op een nutator gedurende 30 minuten bij 4 °c, zodat het homogeen is. Centrifugeer het nucleaire lysaat gedurende 30 minuten bij 21.000 x g bij 4 °c. Pipetteer het supernatant en bewaar als een oplosbaar nucleair eiwitextract.Opmerking: Nuclease behandeling van de resulterende nucleaire pellet maakt het mogelijk voor het herstel van een chromatine-geassocieerde eiwitfractie. Dialyseer het oplosbare nucleaire extract tegen buffer C + Pi’s gedurende 3 uur bij 4 °C. Snijd een passende lengte van 24 mm breedte dialyse slang met een 8 kDa molecuulgewicht afgesneden. Klem één kant van de slang en load nucleoplasm in de buis. Na het laden van het lysaat, klem het andere uiteinde en onderdompelen in een schone glazen container met buffer C + Pi’s. Centrifugeer het gedialyseerde nucleair extract/nucleoplasma bij 4 °C tot 21.000 x g , gedurende 30 min. aliquot 3X 20 μL kern extract voor fractionering validering door Western Blot. Het nucleaire extract dat voor IP-MS-analyse wordt gebruikt, kan worden alicgeciteerd en in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C worden opgeslagen, indien nodig. 3. validering van subcellulaire fractionering Voltooi een eiwit test om de eiwitconcentratie van het nucleaire lysaat te bepalen. Een bicinchonininezuur eiwit test biedt voldoende gevoeligheid voor downstreamtoepassing. Laad 20 μg van zowel de cytosolische als de nucleaire fracties op een SDS-PAGE gel voor de Western Blot-analyse zoals eerder beschreven13. Skip Lanes bij het laden om te voorkomen dat een monster te vermijden. Test de Western Blot voor p84 (THOC1) als een nucleaire marker en GAPDH als een cytosolische marker. Bepaal de mate van fractionering door de verhouding van de cytosolische marker in de nucleaire Fractie en omgekeerd.Opmerking: er kunnen antilichamen voor andere nucleaire en cytosolische markers worden gebruikt. 4. immunoprecipitatie van endogene kern aas eiwit Opmerking: het wordt aanbevolen om vanaf dit punt lage retentie buizen te gebruiken. Hierdoor wordt de niet-specifieke binding aan de buizen tijdens het hanteren van het monster verminderd en wordt onnodig verlies van monster vermeden. Zorg er bovendien voor dat LCMS grade H2O wordt gebruikt om buffers voor te bereiden voor de resterende stappen. Bereid een proteïne-A/G-kraal mengsel voor elke replicaat door een kraal volume van 12,5 μL te combineren voor zowel proteïne-A als proteïne-G in micro centrifugebuizen. Bewaar de kraal voorraden als een slurry met 20% ethanol. Bepaal de concentratie van kralen binnen de slurry% (v/v) en Pipetteer het benodigde volume met behulp van een pipetpunt dat is uitgesneden op de punt om ervoor te zorgen dat de kralen de punt kunnen betreden. Was het eiwit A/G kraal mengsel 2x met 300 μL IP buffer 1. Spin de parels op 1.500 x g bij 4 °c gedurende 1 minuut en decanteren buffer. Bereid de antilichamen-proteïne A/G-kralen: om het antilichaam aan de kralen te binden, voeg 300 μL IP-buffer 1 en 10 μg van het gewenste antilichaam toe. Laat het kraal/antilichaam mengsel op een nacht op een nutator op 4 °C rocken. Voor alleen kraal besturingselementen, geen antilichamen toevoegen.Opmerking: een totaal van 10 μg antilichaam per replicaat kan als uitgangspunt worden gebruikt, maar het exacte bedrag moet worden geoptimaliseerd voor elk afzonderlijk antilichaam en de schaal van het lysaat dat in het experiment wordt gebruikt. Ontdooi de nucleaire lysaten uit stap 2,10 in een waterbad en aliquot-geschikte volumes in microcentrifugebuisjes met lage retentie voor 1 mg eiwit invoer per replicaat. Draai het lysaat op 16.000 x g gedurende 30 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 1 μL benzonase (250 eenheden/μL) per 1 mg nucleair lysaat toe en steen op een nutator bij 4 °C gedurende 10 − 15 minuten. Bereid kralen voor Preclearing van het lysate. Voeg 12,5 μL van elk eiwit A en eiwit G kralen toe aan 1,5 mL lage retentie buizen zoals in stap 4,1. Was 2x met IP Wash buffer 1 + Pi’s en decaner de buffer. Voeg 1 mg nucleair lysaat toe aan de kralen uit stap 4,5. Inincuberen tijdens het schommelen op een nutator gedurende 1 uur bij 4 °C. Centrifugeer voorlerende lysaten bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut. Terwijl nucleaire lysaten in stap 4.5.1 met kralen worden geïnbeend, was de antilichaam-proteïne A/G-kralen 2x met IP-buffer 1 + Pi’s. Centrifugeer bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut en decaner de buffer. Breng het precleared Nuclear lysaat over van stap 4.6.1 op de antilichamen-proteïne A/G-kralen. Inbroed tijdens het schommelen op een nutator bij 4 °C gedurende 4 uur. Centrifugeer na de incubatie bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut. Breng het supernatant over in buizen die zijn gelabeld als de doorstroming voor elke replicaat. Was de antilichaam-proteïne A/G kralen met 1 mL IP buffer 2 + Pi’s. Centrifugeer bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut, decanterende buffer en herhaal dit voor een totaal van 3x. Was de parels 2x met 1 mL IP buffer 1 + Pi’s centrifugeren zoals in de vorige stap. Zorg ervoor dat alle buffer na de laatste wasbeurt wordt verwijderd. Elute 2x met 20 μL 0,1 M glycine (pH 2,75) gedurende 30 min elk. Zorg ervoor dat de buizen schommelen tijdens de incubatie met de elutie buffer. Draai bij 750 x g en 4 °c gedurende 1 minuut en Pipetteer na elke incubatie van 30 minuten het supernatant.Opmerking: terwijl de lage pH Glycine-methode hier beschreven de meeste aas eiwitten, sommige antilichaam-antigeen interacties vereisen strengere buffer voorwaarden. Flash Freeze elueert in vloeibare stikstof en bewaart bij-80 °C. 5. monstervoorbereiding Opmerking: insuline spiked in de immunoprecipitatie elutie monsters helpt bij het herstel van eiwitten tijdens Trichloorazijnzuur (TCA) neerslag en monsterverwerking, wat belangrijk is voor lage overvloed endogene Bait eiwitten. De eluaten bij kamertemperatuur ontdooien indien bevroren. Plaats de monsters op ijs en voeg 10 μL van 1,0 mg/mL insuline toe voor elke 100 μL eluaat. Vortex en voeg vervolgens onmiddellijk 10 μL 1% natrium deoxycholaat toe. Vortex het monster opnieuw en Voeg 30 μL 20% TCA toe, gevolgd door één laatste Vortex. Inbroed de monsters op ijs gedurende 20 minuten en Centrifugeer gedurende 30 minuten op 21.000 x g bij 4 °c. Zuig het supernatant op en Voeg 0,5 mL aceton toe die is voorgekoeld tot-20 °C. Vortex en draai vervolgens op 21.000 x g en 4 °c gedurende 30 min. Herhaal deze stap. Aspireren de supernatant en lucht drogen de pellet overgebleven in de bodem van de buis. Bereid het monster voor massaspectrometrie met behulp van een gemodificeerde filter aided sample prep (FASP) methode, geoptimaliseerd voor het verminderen van de verwerking van monsters, zoals hieronder beschreven14. Rebreng de proteïne pellet uit stap 5.1.4 met 30 μL SDS-alkylatie buffer (Zie tabel 1). Inbroed het monster op een warmte blok van 95 °C gedurende 5 minuten. Laat het gedurende 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u voorafgaat aan de volgende stap. Voeg aan elk monster 300 μL UA-oplossing en 30 μL 100 mM TCEP toe. Laad deze oplossing op een 30-k centrifugale filter. Draai het centrifugale filter op 21.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Opmerking: het aas-eiwit en de putende interactors moeten op dit moment aan het filter worden gebonden. De stroom door kan echter worden bewaard, voor het geval er een probleem is met het filter. Was het filter met 250 μL UA en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 10 min. decaner de stroom doorheen en herhaal dit voor een totaal van 3x. Was het filter met 100 μL 100 mM tris pH 8,5 en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 10 min. decante de stroom door en herhaal dit voor een totaal van 3x. Voeg 3 μL van 1 μg/μL Lys C geresuspendeerd in 0,1 M Tris pH 8,5. Vul de filters tot aan de 100 μL markering en laat 1 uur verteren bij 37 °C tijdens het schommelen op een nutator. Voeg 1 μL van 1 μg/μL MS-graad trypsine toe. Meng zachtjes en laat de trypsine met het monster ‘s nachts bij 37 °C inbrotsen terwijl u op een nutator rockt. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 20 minuten om de peptide van het filter te elzen.Opmerking: er kunnen meerdere Centrifugeer ronden nodig zijn om al het eluaat te herstellen. Als dit niet gebeurt, is er een potentieel voor ernstige monsterverlies. Ontzout de peptiden met C18 spin-kolommen. Volg het protocol dat door de fabrikant is verstrekt. Respendeer het gelyofiliseerd peptide in 7 μL van 0,1% TFA in 5% acetonitril. Sonicate het monster voor 3 min om ervoor te zorgen dat de peptiden zijn geresuspendeerd. Spin naar beneden op 14.000 x g gedurende 10 min. Breng het geresuspendeerde peptide over in een geschikte monster flacon voor het laden op het vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS)-systeem. 6. LC/MS systeem geschiktheid Opmerking: vanwege de kleine schaal en over het algemeen lagere overvloed aan eiwitten uit affiniteit-gezuiverde monsters, is het essentieel dat het LC/MS-platform werkt met een maximale gevoeligheid en robuustheid. Voeg 1 mL LC/MS-klasse-mierenzuur toe aan 1 L LC/MS-kwaliteit water voor mobiele fase A en voeg 1 mL LC/MS-klasse-mierenzuur toe aan 1 L LC/MS-rang acetonitril voor mobiele fase B. Bereid of installeer een 75 μm gesmolten silica capillaire kolom verpakt met < 2 μm omgekeerde fase C18 Resin met een lengte van ≥ 250 mm. De beste resultaten zullen worden verkregen met een directe injectie van monsters in de kolom. Verwijder het Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systeem met nieuwe mobiele fases. Met een C18-kolom geïnstalleerd, een stabiele stroomsnelheid en elektro spray met een geschikte emitter (d.w.z. 20 μm id x 360 μm od getrokken naar een 10 μm punt) vast te stellen. Houd de kolom bij 40 − 60 °C. Test de algehele LC/MS-systeemprestaties door een complexe kwaliteitscontrole standaard te injecteren, zoals 100 − 200ng van een HeLa hele cel lysaat tryptische Digest. Elueer met een geschikte gradiënt voor een complex monster (d.w.z. 2 − 3 h gradiënt elzen tijd). Stel een basislijn systeemprestaties van de peptide en eiwit identificaties.Opmerking: voor de beste resultaten zullen 3000 − 5000 of meer eiwit identificaties van 20000 − 35000 unieke peptiden optimale prestaties bieden voor experimentele monsters. Injecteer voor de routinematige LC/MS-systeem geschiktheid 100 − 200 fmol of minder van één eiwit Digest-standaard, zoals boviene serum albumine (BSA). Elute met een korte gradiënt (d.w.z. 20 − 30 min).Opmerking: Meervoudige injecties van een eiwit Digest helpen bij het vaststellen van de systeemprestaties van de LC/MS-basislijn en herhalen de injectie na elke IP-MS-sample biedt een maatstaf voor de prestaties van het systeem gedurende het experiment en maakt het mogelijk om instrument drift te detecteren, wat kan worden bepaald met label vrije experimenten. Een basislijn van de Selecteer individuele piek intensiteiten en piek vormen zal informeren over MS, LC en kolom prestaties. Om overbelasting van de analytische kolom te voorkomen, laadt u een klein deel (15 − 30% van het totaal) van een experimenteel monster op de kolom en scheidt u het met een gradiënt die geschikt is voor complexe monsters (d.w.z. 2 − 3 uur). Als het aantal eiwit identificaties niet bevredigend is, laadt u het hele monster op de kolom. Voer een standaard met één eiwit samenvatting uit tussen de voorbeelden om de LC/MS-systeemprestaties te bewaken en het karryover te samplen. Er kunnen meerdere normen nodig zijn om de monster overdracht te verminderen, afhankelijk van uw monsters. 7. gegevensverwerking Download het proteomica softwarepakket maxquant gevonden op https://www.maxquant.org/.Opmerking: dit wordt gebruikt voor het verwerken van het ONBEWERKTE MS-gegevensbestand van stap 6,6 in gegevenstabellen van eiwit-Id’s, gennamen en kwantitatieve waarden die zijn gekoppeld aan de identificatie van deze voor downstream-analyse. Selecteer laden in de subkop invoergegevens van het tabblad onbewerkte gegevens . Open de bestandslocatie waar de MS RAW-bestanden worden opgeslagen en selecteer RAW-bestanden voor elke MS/MS-uitvoering. Klik op het groepsspecifieke tabblad en selecteer spijsvertering. Selecteer in de enzym lijst Lysc en klik op de pijl naar rechts om dit enzym toe te voegen aan de lijst die zal worden gebruikt in de zoekopdracht. Selecteer vervolgens instrument en zorg ervoor dat het juiste instrument type wordt weergegeven in de vervolgkeuzelijst boven aan het scherm. Laat andere groepsspecifieke zoekparameters op standaardinstellingen staan. Klik op het tabblad algemene parameters en selecteer reeksen. Voeg het juiste FASTA-bestand toe voor de taxonomie die in deze zoekopdracht wordt gebruikt. Peptiden zullen niet goed worden toegewezen als dit niet wordt gedaan. Download voor het menselijke Proteoom het FASTA-bestand van UniProt op https://www.uniprot.org/help/human_proteome. Klik binnen het tabblad algemene parameters op eiwit kwantificering. Selecteer in het vervolgkeuzemenu peptiden voor kwantificering de optie uniek + scheerapparaat.Opmerking: MaxQuant biedt alternatieve kwantificering van eiwitten door middel van op intensiteit gebaseerde absolute kwantificatie (iBAQ) en labelvrije quantitatie (LFQ). Peptide Count informatie is echter voldoende voor de downstream-analyse in dit protocol15. Selecteer linksonder in de interface MaxQuant het aantal processors dat voor de zoekactie moet worden gebruikt. Dit heeft direct invloed op de tijdsduur die nodig is voor de uitvoering, dus Selecteer zo veel mogelijk voor dit). Klik op Start linksonder in het scherm om de uitvoering te starten. Selecteer het tabblad prestaties boven aan het scherm om de voortgang van de zoekopdracht weer te geven. Wanneer de uitvoering is voltooid, opent u het bestand proteingroups. txt in Perseus, een proteomica-berekenings platform of een ander spreadsheetprogramma om de gegevens16te bekijken. Gebruik Perseus om veelvoorkomende verontreinigingen en hits te verwijderen naar omgekeerde eiwit sequenties. Volg de gedetailleerde Perseus-documentatie op http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.Opmerking: als u het bestand proteingroups. txt opent in analyse software (bijvoorbeeld Excel), worden bepaalde namen van genen en eiwitten automatisch beschadigd. Analyseer experimentele gegevens met behulp van de contaminant-opslagplaats voor Affiniteits zuivering (CRAPome). Registreer een account bij deze repository http://crapome.org/en volg de tutorial zo nodig17,18. Gebruik de analyseren van uw gegevens werkstroom gevonden op de CRAPome homepage. Selecteer externe besturingselementen die corresponderen met het affiniteits zuiveringssysteem dat in dit interactie experiment wordt gebruikt.Opmerking: deze besturingselementen kunnen worden gebruikt voor het berekenen van een tweede vouw verandering verrijking die nuttig is voor het opsporen van algemene verontreinigingen. Genereer een invoerbestand uit de uitvoer van de proteingroups. txt van MaxQuant met behulp van Perseus of een geschikte spreadsheet applicatie. Details voorhand matige opmaak u vinden op http://crapome.org/?q=fileformatting. U ook het opgegeven R-script export_CRAPomeSAINT_Input_File. R gebruiken om het invoerbestand van SAINT/CRAPome te genereren. Zie README. txt in de aanvullende coderings bestanden. Een analyse uitvoeren om te bepalen van de fold-Change verrijking en SAINT (significantie analyse van INTeractome) waarschijnlijkheid voor elk aas eiwit in de immunoprecipitatie. Zorg ervoor dat ‘ gebruiker besturingselementen’ is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu onder FC-A, ‘ crapome Controls ‘ of ‘ alle besturingselementen ‘ zijn geselecteerd in de FC-B vervolgkeuzelijst en waarschijnlijkheids Score is geselecteerd voor het genereren van de kansen van de Heilige. Wanneer de uitvoering is voltooid, weergeven van de uitvoer die beschikbaar is onder ‘ analyseresultaten ‘ samen met een taak-id. Download de data matrix uit de ‘ analyseresultaten ‘ voor toekomstige plotten en data visualisatie. Plot eiwitten als een functie van FC-A (IPs vs. gebruikers controles) en SAINT waarschijnlijkheid door het volgen van de R-scripts zoals voorzien in aanvullende codering bestanden.Opmerking: een reeks R-scripts is bedoeld voor het produceren van plots van FC-A versus SAINT-waarschijnlijkheid en iBAQ vs. log2 (eiwit overvloed), gekleurd door het aangepaste p-waarde bereik van empirische Bayes-analyse van de label vrije intensiteiten. De details van de differentiële statistische analyse en plotten zijn te vinden in README. txt en het R-script “main_differential_analysis. R “in de aanvullende coderings bestanden. Evalueer waar bekende interacties eiwitten van het aas eiwit worden gerangschikt door FC-A en SAINT. Maak een cutoff van FC-a > 3,00 en Saint > 0,7 voor single Bait experimenten in drievoud als uitgangspunt.Opmerking: selectie van afgeknipte voor een “hoog-vertrouwen” interactie en een “weinig vertrouwen” interactie moet worden geïnformeerd door biologische informatie. 8. data visualisatie Opmerking: er zijn veel Programma’s die de gegevens van proteomica (bijv. R, Perseus, cytoscape, String-DB) effectief kunnen visualiseren. Het analyseren van de connectiviteit tussen high-Confidence hits en functionele verrijking van deze interactoren kan een bruikbare strategie zijn voor het prioriteren van hits voor verdere validatie en functionele karakterisering. Download Cytoscape, een open source Network visualisatietool op https://cytoscape.org/download.html19. Bereid een invoerbestand voor interactiegegevens voor als een door tabs gescheiden bestand dat is opgemaakt met drie kolommen: aas (bronknooppunt), prooi (doelknooppunt), type interactie (randtype). Dit kan gedaan worden in Perseus of een spreadsheetprogramma naar keuze. Selecteer de Importeer tabel van het bestands pictogram naar de linkerbovenhoek van het programma (aangeduid met een neerwaartse pijl en een matrix in het pictogram). Cytoscape zal de interactiegegevens automatisch invullen in een netwerk dat klaar is voor aangepaste opmaak en ontwerp. Selecteer het tabblad stijl in het Configuratiescherm voor Cytoscape en klik op de vierkantjes in de kolom def om het kenmerk voor het hele netwerk aan te passen. Selecteer specifieke knooppunten of randen in het netwerk en selecteer vervolgens het vierkant in de kolom Byp. van het menu stijl om de standaardinstellingen te omzeilen en alleen geselecteerde objecten aan te passen. U ook op het dropdownmenu boven aan het menu stijl klikken om de vooraf ingestelde netwerk indelingen weer te geven.Opmerking: tekenreeks-DB eiwit-eiwit interactiegegevens kunnen worden geïntegreerd in dit netwerk op dit moment hetzij handmatig via het invoerbestand of via verschillende verrijkings middelen beschikbaar als plug-ins in Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. Een aanbevolen cytoscape plug-in voor verrijkings analyse is te vinden op http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. Om het vertrouwen te vergroten in de gegevensset die in deze workflow wordt gegenereerd, voert u wederzijdse IP-MS of IP-westerse experimenten uit die gericht zijn op prooi eiwitten die van belang zijn als aas.

Representative Results

De meerderheid van de eiwit massa geïdentificeerd in een IP-MS-experiment bestaat uit niet-specifieke eiwitten. Een van de belangrijkste uitdagingen van een IP-MS-experiment is dus de interpretatie van de eiwitrijke interactoren versus niet-specifieke interactoren. Om de cruciale parameters te demonstreren die worden gebruikt bij de evaluatie van de kwaliteit van de gegevens, analyseerde de studie drievoud immunoprecipitaties van 5 mg Hela nucleair extract met behulp van een kraal alleen controle. De eerste interne controle om ervoor te zorgen dat een IP-MS-experiment betrouwbaar is, is of het aas-eiwit behoort tot een van de hoogste verrijkte eiwitten die worden geïdentificeerd door zowel de fold-Change over de controle als de waarschijnlijkheid van de Heilige. In dit geval wordt het aas DYRK1A gerangschikt onder de bovenste drie verrijkte eiwitten over de controle (Figuur 2a,B). In een nucleaire interactome-studie van DYRK1A, gebruikmakend van vier onafhankelijke antilichamen, voorzag een FC-A-cutoff van > 3.00 en de SAINT-kanscutoff > 0,7 in een strenge cutoff voor de identificatie van zowel nieuwe als eerder gevalideerde interactoren22. Bij toepassing op dit experiment zou een duidelijke scheiding kunnen worden waargenomen tussen de interactoren met een hoog betrouwbaarheids percentage en > 95% van de als niet-specifieke geïdentificeerde eiwitten (Figuur 2a,B). Het toepassen van zowel een fold-Change verrijking als een waarschijnlijkheids drempel verhoogt de striktheid door een consistent hoge verrijking van eiwit-Id’s in biologische replicaten te vereisen. Naast statistische scoring, wijst de CRAPome Analysis workflow ook eerder gerapporteerde interacties toe aan aas-prooi gegevens23. Hoewel deze toewijzing nuttig kan zijn voor drempelmethode-interacties met hoge en lage betrouwbaarheid, kunnen eerder gerapporteerde interacties slecht scoren door FC-A en de kansen van de Heilige, wat mogelijk aangeeft dat veel bekende interacties van een bepaald aas alleen kunnen bestaan in specifieke celtypen, contexten of organellen. Voor het voorbeeld DYRK1A DataSet, iref interactie FC-A waarden waren zo laag als 0,45, wat neerkomt op een zeer lage verrijking over controle (figuur 2c). Om de inflatie van valse positieven te voorkomen, moet statistische drempelwaarde worden uitgevoerd op een manier die de striktheid boven de reductie van valse negatieven prioriteert. Opgemerkt moet worden dat de detectie van deze interacties onafhankelijk van eiwit overvloed was (figuur 2c). Het berekende absolute Kopieer nummer van elke iREF-interactie binnen HeLa-cellen toonde geen correlatie met de detectieniveaus van een interactie partner door IP-MS24. Cytoscape fungeert als een effectief hulpmiddel voor het visualiseren van meerdere lagen van interactiegegevens19. In het DYRK1A immunoprecipitatie-experiment dat hier wordt beschreven, heeft het gecombineerde gebruik van FC-A-> 3,0 en Saint > 0,9 de lijst met zeer betrouwbare interactoren teruggebracht tot zes eiwitten (figuur 2D). Echter, bij het toepassen van een FC-een cutoff van > 3,0 op zichzelf, acht extra eiwitten werden toegevoegd aan het netwerk. Deze extra eiwit interactoren hebben een hoge connectiviteit met de interactoren die al in het netwerk zijn, wat suggereert dat ze worden geassocieerd in vergelijkbare complexen of functionele rollen. Om dit te doen, werd bewijs van de reeks-DB van eiwit-eiwit interacties geïntegreerd in dit netwerk als blauwe onderbroken lijnen20. Terwijl deze single-Bait, drievoud experiment biedt een beperkte steekproef van de volledige DYRK1A interactie netwerk, het gebruik van extra Aas, replicaten, en integratie van grote openbare gegevenssets kan worden gebruikt om het netwerk van High-Confidence interacties uit te breiden. De statistische afgeknipte zullen dus specifiek zijn voor elk individueel experiment en zullen grondig moeten worden geëvalueerd. Figuur 1: representatieve proteomica-workflow voor subcellulaire IP-MS. Cellen worden geteeld in 4 L ronde bodem kolven of 15 cm weefselcultuur gerechten en geoogst op hetzelfde moment voor subcellulaire fractionering. Cellen worden gefractioneerd in een cytosolische, nucleaire en een nucleaire pellet, en immunoprecipitaties worden gedaan van 1 − 10 mg nucleair lysaat met behulp van een of meerdere antilichamen die hetzelfde aas herkennen. Filter aided sample prep (FASP) en offline monster Cleanup worden uitgevoerd voorafgaand aan single-shot massaspectrometrie. Een downstream computationele pijplijn wordt gebruikt om gegevens te verwerken in interpretabel interactiegegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: representatieve gegevens voor een single-BAIT IP-MS-experiment met enkelvoudige antilichamen. A) FC-A en Saint-kansoutput van CRAPome Analysis workflow voor een optimaal experiment met behulp van één antilichaam voor het kinase DYRK1A (n = 3). Voor de vergelijking werden alleen kralen gebruikt. Rode ononderbroken lijnen vertegenwoordigen afgeknipte ingesteld op FC-A > 3,00 en Saint > 0,7. (B) maxquant eiwit abundantie schattingen (iBAQ)-output versus LOG2 ratio van eiwit abundantie in DYRK1A IP to Control, gekleurd door het aangepaste p-waarde bereik van empirische Bayes-analyse van de label vrije intensiteiten. C) FC-A en het geschatte afschrift aantal eiwitten die in de iref-database23,24als interacties met eiwitten worden vermeld. (D) Cytoscape netwerk visualisatie van DYRK1A interactors. Blauwe knooppunten = FC-A > 3,00, SAINT > 0,7. Oranje knooppunten = FC-A > 3,00. Zwarte randen = eiwitten geïdentificeerd als interactoren in IPMS-experiment. Blauwe onderbroken rand = Sint-interactie tussen prooi eiwit (vertrouwen >. 150). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Mengsel van proteaseremmers (PI) Reagens Eindconcentratie Natriummetabisulfiet 1 mM Benzamidine 1 mM Dithiothreitol (DTT) 1 mM Fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) 0,25 mM Mengsel van fosfatase remmers (PhI) Reagens Eindconcentratie Microcystin LR 1 μM Natrium Orthovanadaat 0,1 mM Natriumfluoride 5 mM Subcellulaire fractionering buffers: Buffer A pH 7,9 Reagens Eindconcentratie HEPES 10 mM MgCl2 1,5 mM Kcl 10 mM Buffer B pH 7,9 Reagens Eindconcentratie HEPES 20 mM MgCl2 1,5 mM Nacl 420 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 0,4 mM Glycerol 25% (v/v) Buffer C pH 7,9 Reagens Eindconcentratie HEPES 20 mM MgCl2 2 mM Kcl 100 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 0,4 mM Glycerol 20% (v/v) Immunoprecipitation-buffers: IP-buffer 1 Reagens Eindconcentratie HEPES 20 mM Kcl 150 mM Edta 0,1 mM NP-40 0,1% (v/v) Glycerol 10% (v/v) IP-buffer 2 Reagens Eindconcentratie HEPES 20 mM Kcl 500 mM Edta 0,1 mM NP-40 0,1% (v/v) Glycerol 10% (v/v) SDS alkylatie buffer pH 8,5 Reagens Eindconcentratie Sds 4% (v/v) Chlooracetamide 40 mM TCEP 10 mM Tris 100 mM UA pH 8,5 Reagens Eindconcentratie Ureum 8 M Tris 0,1 M * gebruik HPLC-kwaliteit H2O Tabel 1: buffer composities Aanvullende Codeer bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De hier geschetste proteomica-workflow biedt een effectieve methode voor het identificeren van eiwit-interactoren met een hoog betrouwbaarheids gehalte voor een belangrijk eiwit. Deze aanpak vermindert de complexiteit van het monster via subcellulaire Fractie en richt zich op het verhogen van de identificatie interactie partners door middel van robuuste monstervoorbereiding, offline monster opruimen en strenge kwaliteitscontrole van het LC-MS-systeem. De downstreamgegevens analyse die hier wordt beschreven, maakt een eenvoudige statistische evaluatie mogelijk van de eiwitten die zijn geïdentificeerd als copurifying met het aas. Echter, vanwege een groot aantal experimentele variabelen (schaal, cellijn, antilichaam keuze), elk experiment vereist verschillende afgeknipte en overwegingen met betrekking tot gegevensvisualisatie en verrijking.

De eerste ontwerpoverweging in een IP-MS-experiment is de selectie van antilichamen die zullen worden gebruikt voor de copurificatie van het eiwit dat van belang is, samen met zijn interactie partners. Hoewel de beschikbaarheid van commerciële antilichamen is toegenomen om grotere delen van het menselijke Proteoom gedurende de afgelopen decennia te bedekken, zijn er nog steeds veel eiwitten waarvoor de reagentia beperkt zijn. Bovendien kunnen antilichamen die zijn gevalideerd voor toepassingen zoals de detectie van Western Blot, niet in staat zijn om de doel proteïne selectief te verrijken in een immunoprecipitatie-experiment. Voorafgaand aan het uitvoeren van een grootschalige interactie proteomica experiment, wordt voorgesteld om een IP te voltooien van een 90% Confluent Health 10 cm schotel, of gelijkwaardige cel nummer, en sonde voor het doelwit eiwit van belang door Western blotting. Als er meer dan één antilichaam beschikbaar is voor immunoprecipitatie, wordt er bovendien voorgesteld om meerdere antilichamen te selecteren die epitopen in verschillende delen van het eiwit herkennen. De binding van een antilichaam aan een aas-eiwit kan de noodzakelijke binding-interface voor putatieve interactie partners occlude. Selectie van een secundaire epitoop voor het aas eiwit zal de dekking van het interactie profiel dat wordt geïdentificeerd door een op massaspectrometrie gebaseerd experiment te verhogen.

Een tweede belangrijke overweging ligt in de selectie van de juiste controle voor het onderscheiden van interacties met hoge betrouwbaarheid, van lage-betrouwbaarheid of niet-specifieke interacties van die welke als copurifying met het aas worden aangemerkt. De strengste controle voor een IP-MS-experiment is het voltooien van de immunoprecipitatie van een CRISPR KO-cellijn van het aas. Een dergelijke controle maakt identificatie en filtering van niet-specifieke eiwitten mogelijk die rechtstreeks aan het antilichaam binden in plaats van aan het aas-eiwit. In gevallen waar het genereren van een CRISPR KO cellijn van elk aas eiwit niet haalbaar is, kan een IgG-kraal controle van hetzelfde Isotype van het aas antilichaam worden gebruikt. In experimenten met een panel van antilichamen die meerdere soorten vertegenwoordigen, kan het gebruik van een kralen alleen controle geschikt zijn, maar zal het de snelheid van valse positieven die zijn geïdentificeerd als interactoren met hoge betrouwbaarheid verhogen.

Selectie van de cellijn die wordt gebruikt in een IP-MS-experiment is afhankelijk van verschillende belangrijke factoren. Eiwit expressie en lokalisatie zijn grotendeels afhankelijk van het celtype. Hoewel RNA-expressie schattingen voor de meeste genen in veel veelgebruikte cellijnen kunnen worden gevonden, is eiwit expressie slecht gecorreleerd met RNA-expressie en moet experimenteel worden bepaald²⁵. Cellijnen waarin een aas-eiwit wordt uitgedrukt in een zeer laag kopie nummer moeten worden vermeden om problemen te omzeilen die gepaard gaan met drastische verhogingen van de celkweek schaal die nodig kunnen zijn. Opgemerkt moet worden, echter, dat monstervoorbereiding kan worden geoptimaliseerd voor de detectie van zeer lage overvloed eiwitten. De filter aided sample prep (FASP) methode, terwijl robuust, kan leiden tot een meer dan 50% verlies van peptide in een monster. De Eenpotvaste-fase-Enhanced monstervoorbereiding (SP3) is een efficiënte methode voor het genereren van monsters voor massaspectrometrie analyse die monsterverlies minimaliseert²⁶. Het verhoogde herstel mogelijk gemaakt door de SP3-methode van monstervoorbereiding kan een nuttig alternatief in deze workflow voor de kwantificering van eiwitten die in de buurt van de aantoonbaarheidsgrens vallen.

Deze proteomica workflow is toegepast in vele kern loten, waaronder kinases, E3 ubiquitine ligases en steigers leden van multi subunit complexen. Uitgaande van de juiste validatie van antilichaam reagentia, zal een succesvolle uitvoering van deze workflow resulteren in het opsporen van eiwit nucleaire interactie partners met hoge betrouwbaarheid voor een eiwit van belang.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door een Grand Challenge Grant to W.M.O. van het Linda Crnic Institute for Down Syndrome en door een samenwerkingsovereenkomst tussen DARPA 13-34-RTA-FP-007. We willen Jesse Kurland en Kira Cozzolino bedanken voor hun bijdragen in het lezen en becommentariëren van het manuscript.

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	4561096
acetone (HPLC)	Thermo Fisher Scientific	A949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column	Millipore Sigma	UFC503096
Benzamidine	Sigma-Aldrich	12072
benzonase	Sigma-Aldrich	E1014
Chloroacetamide	Sigma-Aldrich	C0267
Dialysis tubing closure	Caroline Biological Supply Company	684239
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47724
Glycerol	Fisher Scientific	887845
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
HeLa QC tryptic digest	Pierce	88329
HEPES	Fisher Scientific	AAJ1692630
insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
KONTES Dounce homogenizer 7 ml	VWR	KT885300-0007
Large Clearance pestle 7ml	VWR	KT885301-0007
Lysyl endopeptidase C	VWR	125-05061
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	208337
Microcystin	enzo life sciences	ALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Substitute solution	Sigma-Aldrich	98379
p84 antibody	GeneTex	GTX70220
Phosphate Buffered Saline
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Pierce BSA Protein Digest, MS grade	Thermo Fisher Scientific	88341	LCMS QC
Pierce C18 spin columns	Thermo Fisher Scientific	PI-89873
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057	For mass spectrometry sample prep
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0618-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Silica emitter tip	Pico TIP	FS360-20-10
Small Clearance pestle 7ml	VWR	KT885302-0007
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	201154
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing	Thomas Scientific	3787K17
TC Dish 150, Standard	Sarstedt	83.3903	Tissue culture dish for adherent cells
TCA	Sigma-Aldrich	T9159
TCEP	Thermo Scientific	PG82080
TFA	Thermo Fisher Scientific	28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS	Thermo Fisher Scientific
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Urea	Thermo Fisher Scientific	29700
Waters ACQUITY M-Class UPLC	Waters
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm)	Waters	186007484	nanoflow C18 column

References

Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
Mahmood, N., Xie, J. An endogenous ‘nonspecific’ protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. 遗传学. 200, 47-59 (2015).
Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old, W. M. Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling. J. Vis. Exp. (153), e60432, doi:10.3791/60432 (2019).