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医学

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

Published: June 22, 2020
doi:
10.3791/60427
, , , , , ,
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina,Universidade do Porto, 2Department of Physiology,Kilimanjaro Christian Medical University College

Summary

Questo protocollo mira a descrivere passo dopo passo la tecnica di estrazione e valutazione della funzione cardiaca utilizzando cardiomiociti scuoiati. Questa metodologia consente la misurazione e la modifica acuta della funzione di miofilamento utilizzando piccole biopsie congelate che possono essere raccolte da diverse posizioni cardiache, dai topi agli uomini.

Abstract

In questo articolo, descriviamo i passaggi necessari per isolare un singolo cardiomiocita permeabilizzato (“scuoiato”) e attaccarlo a un apparato di misurazione della forza e a un motore per eseguire studi funzionali. Questi studi consentiranno di misurare la rigidità del cardiomiocita (forza passiva) e la sua attivazione con diverse soluzioni contenenti calcio (Ca2+) per determinare, tra gli altri: massimo sviluppo della forza, miofilamento Ca2+-sensibilità (pCa50),cooperatività (nHill) e tasso di riqualificazione della forza (ktr). Questo metodo consente anche di determinare gli effetti dei farmaci che agiscono direttamente sui miofilamenti e dell’espressione di proteine ricombinanti esogene sulle proprietà attive e passive dei cardiomiociti. Clinicamente, studi cardiomiociti scuoiati evidenziano la fisiopatologia di molte malattie del miocardio e consentono una valutazione in vitro dell’impatto degli interventi terapeutici mirati ai miofilamenti. Complessivamente, questa tecnica consente di chiarire la fisiopatologia cardiaca studiando correlazioni tra parametri in vitro e in vivo nei modelli animali e nel tessuto umano ottenuti durante la chirurgia a cuore aperto o trapianto.

Introduction

Tradizionalmente, la valutazione delle proprietà meccaniche del miocardio è stata tentata principalmente in preparati multicellulari, come i muscoli papillari e le trabecole1,2. Le strisce muscolari cardiache multicellulari includono una popolazione eterogenea di cellule, compresi i cardiomiociti contrattili con un modello sconosciuto di orientamento e generazione di forza, attività elettrica e distribuzioni di stress / ceppo, nonché una matrice di tessuto connettivocircostante 3,4. Una preparazione senza collagene e contenente un singolo cardiomiocita consentirebbe di misurare la lunghezza del sarcomero e le proprietà della contrattile a ponte trasversale in modo molto preciso econtrollato 5,6. Pertanto, negli ultimi quattro decenni, sono state sviluppate diverse metodologie che consentono di indagare le proprietà meccaniche, contrattili e di rilassamento di un singolo cardiomiocita6,7. La funzione contrattile di queste cellule dipende fortemente dalla lunghezza del sarcomero e dalla cinetica ciclistica a pontetrasversale 3. Pertanto, è auspicabile indagare la funzione muscolare direttamente in singole cellule cardiache isolate, considerando che consente di valutare la lunghezza e le prestazioni del sarcomero, nonché la funzione cross-bridge e le proprietà contrattili. Tuttavia, isolare e collegare cardiomiociti funzionali con una ragionevole risoluzione ottica del sarcomero durante la registrazione della misurazione della forza a livello μN è ancora impegnativo e inevoluzione 3,6. Altre sfide sono la logistica che deve essere installata per isolare i cardiomiociti dalle biopsie appena raccolte. L’imprevedibilità della raccolta di biopsie umane, ad esempio, può compromettere la fattibilità degli esperimenti.

Inoltre, le preoccupazioni etiche riguardanti la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento della sperimentazione animale per le procedure scientifiche (principi dei 3R) hanno promosso cambiamenti di studio a livello cellulare e tissutale, preferibilmente nelle biopsie umane o in campioni animali più piccoli. Infatti un progressivo perfezionamento delle metodologie per valutare la funzione cardiaca in vitro a un livello più ridotto di complessità consente una corretta integrazione dei risultati a tutto il corpo e tradurli nello scenarioclinico 7. Complessivamente, l’utilizzo di campioni conservati a -80 °C per estrarre i cardiomiociti può essere un’alternativa interessante.

Il tessuto miocardico viene tagliato a pezzetti e omogeneizzato con un mortaio e un pestello. Il risultato di questa omogeneizzazione è una sospensione di cellule scuoiate in bundle e isolate con vari gradi di danno sarcolemmale, in cui il mioplasma è esposto al mezzo di balneazione e tutti i componenti cellulari vengono lavati. Strutture come le miofibrille che sono più lontane dal sarcolemma sono conservate. Pertanto, l’accorciamento del sarcomero e le proprietà funzionali associate all’apparato miofibrillare sono mantenuti intatti e possono essereregistrati 8,9.

Il sistema di misurazione della forza cardiomiocita è costituito da un motore elettromagnetico, utilizzato per regolare la lunghezza dei cardiomiociti, e da un trasduttore di forza, che misura la contrazione cardiomiocitalica isometrica. Un cardiomiocita permeabilizzato, o scuoiato, viene posto in una camera sperimentale contenente una soluzione rilassante ([Ca2+] < 10 nM) e incollata al silicio a 2 aghi sottili: uno attaccato al motore e l'altro al trasduttore di forza. Un sistema ottico viene utilizzato per determinare la morfologia dei cardiomiociti e la lunghezza del sarcomero. Il protocollo sperimentale consiste spesso in una serie di registrazioni di forza su soluzioni tampone contenenti diverse concentrazioni di Ca2+, la determinazione della cinetica a ponte trasversale actina-miosina e la misurazione della tensione passiva dei cardiomiociti montati a lunghezze di sarcomere predefiniti (Figura 1). L’isolamento dei cardiomiociti permeabili da campioni miocardici congelati in azoto liquido (e successivamente conservati a -80 °C) è una tecnica che utilizza la meccanica cellulare e la biochimica proteica per misurare la forza massima attivata(attiva) ca 2+per area di sezione trasversale (Tattiva,kN-m-2), Ca2+-tensione indipendente (passiva) (Tpassivo, kN-m-2), miofilamenti Ca2+-sensibilità (pCa50),cooperatività dei miofilamenti (nHill), tasso di riqualificazione della forza (ktr) e dipendenze di lunghezza sarcomere di Tattivo,Tpassivo,pCa50, nHill e ktr.

L’obiettivo di questo protocollo è illustrare e riassumere il potenziale del sistema di misurazione della forza cardiomiocita come procedura affidabile per valutare le proprietà meccaniche funzionali dei cardiomiociti a pelle singola isolati da campioni congelati di diverse specie.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi alla Guida alla cura e all’uso degli animali da laboratorio (pubblicazione n. 85-23 della NIH, rivista nel 2011) e alla legge portoghese sul benessere degli animali (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Le autorità locali competenti hanno approvato questo protocollo sperimentale (018833). 1. Preparazione delle soluzioni stock(tabella 1) Preparare 1.000 mL di soluzione rilassante per l’isolamento dei cardiomiociti (RELAX-ISO) seguendo le istruzioni della tabella 2. Sciogliere il reagente sopra in ≈500 mL e regolare il pH a 7,0 con KOH. Regolare il volume finale a 1000 mL. Distribuire RELAX-ISO in tubi da 50 ml. Conservare a -20 °C. Preparare 250 mL di soluzione attivante seguendo le istruzioni della tabella 3. Sciogliere i reagenti sopra in ≈100 mL di acqua ultra pura. Regolare il pH a 7,1 con 5 M KOH a 15 °C.NOTA: Di solito, è necessario aggiungere una quantità significativa di KOH per raggiungere il pH desiderato. Mettere il palloncino volumetrico in una scatola con ghiaccio per raffreddare la soluzione a 15 °C. Regolare il volume finale a 250 mL. Agitare continuamente questa soluzione con un agitatore magnetico fino al momento della miscelazione con la soluzione rilassante. Preparare 100 mL di soluzione rilassante seguendo le istruzioni della tabella 4. Sciogliere i reagenti sopra in ≈50 mL di acqua ultra pura. Regolare il pH a 7,1 con KOH 5 M a 15 °C.NOTA: Di solito, è necessario aggiungere una quantità significativa di KOH per raggiungere un pH di 7,1. Posizionare il palloncino volumetrico in una scatola piena di ghiaccio per raffreddare la soluzione a 15 °C. La resistenza ionica delle soluzioni utilizzate durante le misurazioni ammontava a 180 mM. Regolare il volume finale a 100 mL. Agitare continuamente questa soluzione con un agitatore magnetico fino al momento della miscelazione con soluzione attivante. Mescolare soluzioni attivanti e rilassanti nelle proporzioni presentate nella Tabella 5 per ottenere soluzioni pCa tra 5.0 e 6.0. Continua sempre a rilassarti e attivare le soluzioni agitando durante la miscelazione di entrambi. Aliquota ogni miscela a 2 microtubi mL. Conservare tutti i microtubi a -20 °C. Preparare un lotto diverso di soluzione pCa (da 4.5 a 6.0) per ogni protocollo. 2. Taratura del trasduttore di forza NOTA: La taratura del trasduttore di forza è una procedura di routine che deve essere eseguita ogni due mesi o ogni volta che si sospetta che non sia calibrata. Il trasduttore di forza è altamente sensibile ed è facilmente rotto. Deve essere maneggiato delicatamente in ogni fase del suo utilizzo, tra cui calibrazione, incollaggio del cardiomiocita e pulizia. Staccare il trasduttore di forza dal resto dell’apparato. Con l’aiuto di un morsetto, posizionare il trasduttore di forza orizzontalmente in modo tale che l’ago punti verso il basso nello stesso orientamento in cui il cardiomiocita svilupperà la forza. Ciò faciliterà l’impiccagione di una serie di masse con pesi noti (elastica, sutura o perno).NOTA: Controllare le caratteristiche del trasduttore di forza prima di procedere a questo passaggio per controllare il fattore di scala [mg/volt] ed evitare un peso eccessivo sul trasduttore. Per il modello del trasduttore di forza, il fattore di scala è 50 (50 mg corrispondono a 1 volt) e usiamo 5 pesi tra 12,5 e 250 mg. Accendere il trasduttore di forza e lasciarlo riscaldare per 30 minuti. Iniziare appendendo la massa più leggera sul trasduttore di forza e registrando la tensione corrispondente misurata a FORCE OUT. Ripetere questa procedura per un massimo di cinque pesi. Forza di plottaggio applicata al trasduttore di forza (carico) rispetto alla tensione e controllo della linearità. Se non c’è linearità, regolare lo zero e guadagnare potenziometri nel circuito stampato del trasduttore. Controlla le sue istruzioni specifiche per ulteriori informazioni. Ruotare il potenziometro zero fino a quando la tensione di uscita non legge 0,0 V. Consegnare un peso medio sull’ago del trasduttore e regolare il potenziometro di guadagno per leggere la tensione corrispondente (ad esempio, 50 mg corrispondono a 1 V). Rimuovere il peso e riregolare il potenziometro zero a 0,0. Ripetere il passaggio 2.6.2 fino a quando l’uscita con e senza il peso non è corretta. Rimontare il trasduttore di forza nell’apparato. 3. Impostazione dell’apparato sperimentale Scongelare una fiala di ciascuna delle soluzioni di attivazione, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 e rilassanti e mantenerle sul ghiaccio.NOTA: ATP e PCr sono composti labili che devono essere mantenuti a temperature fredde. Preparare il microscopio, l’apparecchio di prova e il relativo elaboratore per l’uso( figura 1). Regolare la temperatura in modo che il termometro in camera legga 15 °C. Eseguire tutti gli esperimenti a questa temperatura ad eccezione delle incubazioni di chinasi e fosfatasi (20 °C). Accendere il trasduttore di forza e il motore. 4. Estrazione e permeabilizzazione dei cardiomiociti scuoiati Scongelare 50 mL di soluzione RELAX-ISO. Accendere la centrifuga e raffreddarla velocemente fino a 4 °C. Scongelare 3-5 μg di un campione di miocardio in una piastra di Petri contenente 2,5 mL di soluzione RELAX-ISO. Tagliare il tessuto a piccoli pezzi con una lama bisturi (Figura 2). Tagliare il campione in modo preciso per evitare danni alle cellule non necessarie. Trasferire i 2,5 mL della soluzione RELAX-ISO con il tessuto su un vetro Potter-Elvehjem utilizzando una punta di pipetta tagliata. Interrompere meccanicamente il tessuto con una smerigliatrice a una velocità di rotazione di 30-40 giri/min. Premere il tessuto 3 volte per 2 s ciascuno per ottenere una buona sospensione cellulare. Preparare il 10% di Tritone in soluzione RELAX-ISO (250 μL di Tritone con 2,25 ml di RELAX-ISO) in un tubo da 15 ml e aggiungere questa soluzione alla sospensione cellulare. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 3 volte. Incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e 4 minuti sul ghiaccio. Lavare il Tritone aggiungendo RELAX-ISO fino alla parte superiore del tubo da 15 ml; mescolando delicatamente (invertendo 3 volte il tubo) e infine girando verso il basso le cellule in una centrifuga angolata (1 min a 348 x g). Rimuovere il supernatante fino a 3 mL sopra il pellet cellulare.NOTA: Rimuovere delicatamente il supernatante per evitare di disturbare il pellet cellulare. Tuttavia, alcune cellule in supernatante saranno inevitabilmente perse. Ripetere il passaggio 4.10 almeno 4 volte o fino a quando non si osservano più bolle prodotte dai residui di Triton.NOTA: Più passaggi di lavaggio vengono fatti, più cellule vengono perse con il supernatante scartato. Nell’ultimo wash-out, rimuovere il supernatante fino a un volume di 5-10 mL di sospensione cellulare. 5. Selezione e incolla del cardiomiocita scuoiato Mettere una goccia di sospensione cellulare su un coverslip sopra uno scivolo di vetro nel porta scorrevole del microscopio (Figura 1). Selezionare un singolo cardiomiocita a forma di asta con un buon modello di striation e dimensioni (Figura 2). Trova le punte dell’ago del trasduttore di forza e del motore usando l’ingrandimento più basso del microscopio invertito. Ruotare il coverslip per posizionare il cardiomiocita selezionato orizzontalmente in modo che le sue estremità siano allineate con l’ago del trasduttore di forza e del motore (Figura 2). Posizionare una sottile linea di colla sul lato del coverslip con l’aiuto di una punta del tampone (Figura 2). Immergere le punte dell’ago del trasduttore di forza e del motore nella linea di colla per creare un alone di colla intorno a entrambe le punte.NOTA: I passaggi da 5.6 a 5.10 vengono realizzati attraverso un uso attento dei micropositori motorizzati. Spostare rapidamente le punte dell’ago vicino al piano focale del cardiomiocita. Spostare la punta dell’ago del trasduttore di forza verso il basso in modo che si incolli a un bordo del cardiomiocita. Ripetere questa procedura con la punta del motore e l’altra estremità della cella.NOTA: Questa procedura deve richiedere meno di 2-3 minuti poiché la colla inizia a polimerizzare molto velocemente. Dopo 5-8 minuti, sollevare gli aghi ≈ 15 μm per evitare di incollare la cella al coverslip. Questo viene fatto spostando entrambi i micromanipolatori contemporaneamente. Lascia che la colla guarisa. Questa procedura può durare da 15 a 45 minuti, a seconda del tipo di colla. Nel nostro caso, il cardiomiocita è adeguatamente incollato dopo ≈15 min. 6. Registrazione delle misurazioni della forza di sensibilità attiva, passiva e Ca2+ Riempire il primo pozzo sperimentale con la soluzione rilassante (55-100 μL nell’apparato sperimentale) e il secondo pozzo sperimentale con soluzione attivante. Utilizzando il software della fotocamera, posizionare la regione di interesse (ROI) in un’area del cardiomiocita con un chiaro modello di striation.NOTA: Per i miociti cardiaci, la lunghezza del sarcomero operativo varia tra 1,8 e 2,2 μm e la lunghezza ottimale del sarcomero è di circa 2,15 μm. Misurare la distanza tra i due estremi del cardiomiocita (dal motore all’alone di colla del trasduttore, figura 3) dopo che è stata impostata la lunghezza ottimale del sarcomero (2,2 μm). Registrare il valore come lunghezza del miocita nel software. Misurare la larghezza e la profondità del cardiomiocita, quest’ultimo con l’aiuto di uno specchio prisma posizionato perpendicolarmente alla cellula.NOTA: Per visualizzare la cella attraverso il prisma sarà necessaria una potente sorgente luminosa esterna. Nel caso in cui non ci sia prisma, e supponendo che le cellule cardiache abbiano una forma ellittica, la profondità del cardiomiocita può essere dedotta come il 70% della larghezza del cardiomiocita. Calcolare l’area della sezione trasversale (CSA, mm2) assumendo una forma ellittica del cardiomiocita. Spostare delicatamente lo stadio del microscopio in modo che la cellula si sposti dal coverslip al pozzo contenente una soluzione rilassante sul retro del palco.NOTA: Questa procedura può facilmente danneggiare la cellula. Prima di spostare la cella, spostare delicatamente gli aghi un po ‘di più. Evitare di rimuovere la cella dalla soluzione. Selezionare il protocollo nel software che contiene due accorciamento delle celle (80% della lunghezza iniziale), che si verificherà quando la cella viene emersa rispettivamente nella soluzione Ca2+ e in soluzione rilassante (Figura 1, File supplementare).NOTA: Il primo “Slack” della cella verrà eseguito all’interno della soluzione attivante e il secondo “Slack” all’interno di una soluzione rilassante. In questo modo, l’utente sarà in grado di calcolare la forza totale (Ftotale)della cella da 1st e la forza passiva (Fpassiva)della cella dal 2°. Utilizzare la formula per calcolare la forza attiva, Fattiva = Ftotale – Fpassiva. La cella viene accorciata dell’80% per staccare tutte le forze record dei ponti trasversali. Elicit contrazione isometrica spostando lo stadio del microscopio in modo che il cardiomiocita passi dalla soluzione rilassante a quella attivante (pCa=4.5(1)).NOTA: Se la cella è funzionale, si contrarrà immediatamente. Una volta raggiunto l’altopiano della forza, inizia a registrare i dati della forza.NOTA: I test possono essere eseguiti singolarmente. A seconda del software c’è la possibilità di creare una sequenza di test che corrisponderà alle diverse soluzioni Ca2+ all’interno di un protocollo di sensibilità Ca2+(Figura 1, File supplementare). Attendere ~10 s e quindi cambiare la cella immersa nella soluzione attivante.NOTA: È importante attendere 10 s prima di immergere la cella in soluzione rilassante. Se la cella viene spostata troppo presto, è possibile che si perdino dati importanti per calcolare la forza di riqualificazione della cella (valore ktr). Sposta rapidamente il palco in modo che il cardiomiocita si immergi nella soluzione rilassante. Attendere che il test si fermi. Ripetere i passaggi da 6.8 a 6.12 in modo che la cella sia attivata due volte nella soluzione attivante (pCa=4.5(2)).NOTA: In genere, dopo la prima attivazione, le estremità del cardiomiocita possono staccarsi leggermente dalle punte dell’ago, cambiando la lunghezza del cardiomiocita, la CSA e / o la lunghezza del sarcomero. Riregolare la lunghezza del sarcomero desiderata e introdurre le dimensioni corrette nel software. Continuare al passaggio 6.13.2 per il protocollo di sensibilità Ca2+ o salvare i dati, se i valori di forza passiva e attiva della cella sono gli unici parametri necessari e staccare la cella dagli aghi e pulirli con acetone per rimuovere la colla. Regolare la lunghezza del sarcomero della cella a 2,2 μm allungando leggermente di nuovo, se necessario. Sostituire la soluzione di attivazione con la successiva soluzione Ca2+ (55-100 μL qui). Ripetere i passaggi da 6,8 a 6,12. Sostituire la soluzione di attivazione con la successiva soluzione Ca2+ (qui 55-100 μL) e ripetere i passaggi da 6,8 a 6,12 fino a quando tutte le soluzioni non sono state testate (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0). Infine, riattivare la cella con soluzione attivante (pCa4.5(3)). Ripetere i passaggi da 6,8 a 6,12. 7. Incubazione con chinasi e fosfatasi Dopo aver eseguito il protocollo di base selezionato, diluire la chinasi/fosfatasi in soluzione rilassante alla concentrazione raccomandata.NOTA: Si raccomanda di effettuare una curva dose-risposta prima dell’esperimento. Impostare la temperatura dei pozzi sperimentali a 20 °C. Riempire i pozzi sperimentali con chinasi/fosfatasi, soluzione rilassante e soluzione attivante (55-100 μL). Spostare delicatamente lo stadio del microscopio in modo che la cellula si immergi nel pozzo contenente chinasi/fosfatasi. Incubare il cardiomiocita con la chinasi/fosfatasi per almeno 30 minuti o secondo le istruzioni dei produttori. Ripetere il protocollo di base selezionato. 8. Finalizzare l’esperimento Scollare il cardiomiocita dalle punte del trasduttore di forza e del motore allungando la cellula. Rimuovere con cura l’alone di colla dalle punte dell’ago usando un batuffolo di cotone imbevuto di acetone. Spegni l’attrezzatura. 9. Analisi dei dati Raccogli tutti i file da ogni cardiomiocita testato.NOTA: Ogni test corrisponderà a un file. Ciò significa che per ogni soluzione Ca2 + o lunghezza del sarcomere, ci sarà un file corrispondente. Calcola le forze attive e passive di un singolo cardiomiocita. Aprire il file corrispondente alla prima attivazione (pCa=4.5(1)) utilizzando un foglio di calcolo (Figura 3A, Appendice A nel file supplementare).NOTA: abbiamo utilizzato un programma su misura per eseguire l’analisi. Vedere l’appendice A nel fascicolo complementare. Valori ≈60 precedenti e valori medi di ≈60 dopo il margine diflessibilità di 1 st della cella (quando la cella è immersa nella soluzione Ca2+). Questi 2 valori corrispondono rispettivamente ad a e b. Ripetere la stessa analisi per il secondomargine di flessibilità della cella (quando la cella è immersa in una soluzione rilassante). Questi 2 valori corrispondono rispettivamente a c e d. Calcolare la differenza tra a e b (forza totale,totaleF ). Calcolare la differenza tra c e d (forza passiva, Fpassiva). Calcola forza attiva, Fattiva = Ftotale – Fpassiva. Normalizzare tutti i valori di forza in CSA (vedi formula sopra) per ottenere la tensione totale (Ttotale),la tensione passiva (Tpassiva)e la tensione attiva (Tattiva). Ripetere il passaggio da 9.2.1 a 9.2.5 per laseconda attivazione (pCa=4.5(2)). Considerare questi valori come quelli che rappresentano Ttotale,Tattivo e Tpassivo del cardiomiocita in esame.NOTA: La prima attivazione della cella con pCa4.5(1) è solitamente associata ad alterazioni delle dimensioni cellulari. Per questo motivo, la seconda attivazione con pCa4.5 è più accurata ed è quella da utilizzare. Ripetere i passaggi da 9.2.1 a 9.2.5 per ogni soluzione testata file/pCa (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)). Calcolare pCa50 e nHill di un singolo cardiomiocita.NOTA: Per questa analisi, utilizzare i valori attiviF non normalizzati dei file 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 e 4.5(3). Inserire in un file di foglio di calcolo tutti i valori non normalizzati di Fattivi per ogni soluzione Ca2+ testata (4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)). Calcolare il fattore di correzione = Fattivo [4.5(2)] – Fattivo [4.5(3)] / 7. Calcolare i valori corretti di Fattivo per ogni soluzione Ca2+ (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) sottraendo Fattivo – fattore di correzione. Calcolare la forza relativa(relativaF) per ogni soluzione Ca2+ normalizzando ogni valoreattivo F in base al valore corretto corrispondente.NOTA: Ilparente F [4.5(3)] dovrebbe essere uguale a 1. Ogni protocollo sperimentale inizia e termina con un’attivazione di controllo alla concentrazione di Ca2+ saturante (pCa 4.5(2) e 4.5(3)). Ciò consente la normalizzazione della forza e la valutazione del rundown dei preparati attraverso il confronto delle variazioni nella forza massima attivata da Ca2+(Fmax). Se, al termine del protocollo sperimentale, il cardiomiocita produce meno del 70% della forza massima della prima contrazione, tale cellula/misurazione dovrebbe essere esclusa dall’analisi. Utilizzare ilparente F e i valori pCa corrispondenti per adattarsi a una curva sigmoidale con la seguente equazione F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill). Estrapolare i valori pCa e nHill dall’equazione sopra menzionata. Calcolare il tasso di riqualificazione della forza (ktr) di un singolo cardiomiocita. Eseguire un adattamento alla curva che corrisponde ai valori immediatamente dopo il margine di flessibilitàdella cella 1 st. Calcola la pendenza della curva e questo valore corrisponderà al tasso di riqualificazione della forza. Ripetere i passaggio 9.4.1 e 9.4.2 per ogni soluzione Ca2+.NOTA: Si oscurerà una scarsa vestibilità della curva per le soluzioni Ca più basse (R al quadrato≤0,90).

Representative Results

I cardiomiociti permeabili funzionali dovrebbero apparire uniformi e con un modello di striation coerente durante l’intero esperimento. Sebbene si prevede un certo grado di deterioramento e di diminuzione della forza dopo esperimenti prolungati, i valori della tensione attiva dovrebbero essere relativamente stabili. Le celle che mostrano chiari segni di perdita di strinazione o significativa diminuzione della forza (< 15 kN-m-2 o <80% della sua forza attiva iniziale) devono essere escluse. La tabella 6 mostra i valori normali previsti per i parametri più importanti derivati da roditori, suini e campioni umani. I parametri ottenuti dipendono principalmente dal protocollo scelto. La figura 5 mostra tracce rappresentative di forza di 3, su 8, registrazioni di forza necessarie per eseguire un protocollo di miofilamento Ca2+-sensibilità. Trasferendo la cellula in un pozzo contenente la soluzione attivante, il cardiomiocita inizia a sviluppare forza fino a raggiungere un altopiano. Dopo un rapido test di rilassamento (durata di 1 ms), in cui il cardiomiocita si accorcia all’80% della sua lunghezza, otteniamo i valori di base di forza zero. Dopo il test di rilassamento, la cellula continua a sviluppare forza mentre è immersa nella soluzione attivante. La forza totale(totaleF ) viene calcolata sottraendo il valore del plateau dal valore minimo. La pendenza dell’ultima parte di questa curva ci dà il valore del tasso di riqualificazione della forza (ktr) (Figura 6), che è una misura della velocità apparente di attacco e distacco del ponte incrociato (fapp e gaap)10. Quando il valore ktr R2 è <0,90 il valore ktr deve essere escluso e di solito ciò avviene a concentrazioni ca2+ inferiori (pCa 5.6, 5.8 e 6.0). Dopo aver trasferito la cellula in un pozzo contenente la soluzione rilassante, la cellula si rilassa e la sua forza diminuisce. La forza passiva (Fpassiva)viene calcolata sottraendo il valore minimo (ottenuto dopo un prolungato accorciamento cellulare) a questo nuovo valore di forza. La forza attiva deriva dalla differenza tra Ftotale e Fpassivo. La forza massima attiva e passiva che caratterizza un cardiomiocita è quella derivata dalla seconda attivazione cellulare con una soluzione ca2+saturante (pCa = 4,5). La prima attivazione viene solitamente scartata in quanto la lunghezza del sarcomero spesso deve essere riadattata. Per eseguire un protocollo di sensibilità Ca2+del miofilamento, è necessario eseguire almeno 9 prove di attivazione (4.5; 4.5; 5.2; 5.6; 6.0; 5.0; 5.4; 5.8 e 4.5). Questa sequenza è semplicemente esemplificante, ma dovrebbe sempre iniziare con 4,5 (due volte) e terminare con 4,5. La programmazione del software di acquisizione dati per un protocollo di miofilamento Ca2+-sensitivity è illustrata nella figura 1 del file supplementare. Dopo aver calcolato la forza attiva per tutte queste soluzioni di attivazione, verificare se l’ultima attivazione ha prodotto più dell’80% della forza massima iniziale (altrimenti i risultati di questa cella devono essere scartati, come accennato in precedenza). Per correggere il declino di Fmax durante la serie sperimentale, i valorimax F interpolati possono essere utilizzati per normalizzare i punti dati. I dati normalizzati possono essere adatti a una curva sigmoidale con la seguente equazione F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). I valori di parametro ottenuti rappresentano la sensibilità al calcio (Ca50, che può essere convertito in pCa50) e la cooperatività (nHill). Tutti i valori di forza possono essere convertiti in valori di tensione dopo la normalizzazione nell’area della sezione trasversale. Oltre alla sensibilità al miofilamento Ca2+e ai protocolli di attivazione dipendenti dalla lunghezza, è possibile eseguire altri test. Questo è il caso delle dipendenze di lunghezza sarcomere di Tattivo, Tpassivo (Figura 7) e forza residua cardiomiocita. Le registrazioni della forza residua sono calcolate dal recupero iniziale della forza (pCa 4.5) raggiunto dopo il cambio di lunghezza della cella (80%) e normalizzato ad ogni forza totale allo stato stazionario raggiunta prima della modifica dellalunghezza 11. L’aumento della forza residua è solitamente indicativo di ponti trasversali con bassa cinetica di distacco e maggiore rigidità. Infine, dovremmo sottolineare che questa tecnica può essere eseguita in cardiomiociti scuoiati estratti meccanicamente da campioni congelati o appena raccolti, nonché isolati enzimaticamente seguiti dalla permeabilizzazione delle sue membrane. Il modo in cui i cardiomiociti sono isolati influisce in modo significativo sui risultati derivati da questa tecnica. La figura 8 mostra le differenze osservate tra le tre procedure di isolamento. Figura 1: Schema integrato dell’apparecchio di prova. L’apparecchio di prova comprende il microscopio, i micromanipolatori e il computer associato. Il fondo della figura mostra un cardiomiocita scuoiato incollato tra il motore e il trasduttore di forza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Diagramma di flusso del protocollo di isolamento cellulare, permeabilizzazione e incollaggio. L’immagine dell’angolo in alto a sinistra è composta da 4 immagini che mostrano pezzi del campione cardiaco nella soluzione RELAX-ISO (A) in una piastradiPetri, ( B ) in un tubo utilizzato per l’omogeneizzazione meccanica del tessuto, (C) l’omogeneizzatore, (D) il tessuto immediatamente dopo l’omogeneizzazione e (E) quando si trova in un tubo per la permeabilizzazione tritone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Determinazione della lunghezza e della lunghezza del sarcomero di un cardiomiocita scuoiato. Determinazione della lunghezza e della larghezza delle celle a una lunghezza del sarcomero di ≈2,2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Protocollo di attivazione dipendente dalla lunghezza (imita il meccanismo di starling franco in vitro). Tracce di forza rappresentative e parametri derivati dai protocolli di sensibilità Ca2+ dei miofilamenti eseguiti prima(A, 1,8 μm) e dopo aver allungato un cardiomiocita fino a 2,2 μm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Protocollo di sensibilità Myofilaments Ca2+. Tracce di forza rappresentative e parametri derivati. Per semplicità, vengono raffigurate solo 3 curve di forza su 8. Vale a dire un cardiomiocita attivato con la soluzione saturante, intermedia e la più bassa contenente Ca2+(rispettivamente 4,5, 5,6 e 6,0). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Tracce rappresentative di una cellula cardiaca di topi attivata in diverse soluzioni di calcio e della rispettiva curva di adattamento ktr. (A) pCa 4.5; (B) pCa 5.0; (C) pCa 5.2; (D) pCa 5.4; (E) pCa 5.6; (F) valori pCa 6.0 ed E per la tensione totale, passiva e attiva, valore ktr e Rsquare per ktr fit. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Protocolli delle dipendenze di lunghezza sarcomere di Tpassivo (A) e Tattivo (B). La tensione passiva e la tensione attiva sono state calcolate in un singolo cardiomiocita ad una lunghezza del sarcomero da 1,8 μm a 2,3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Risultati rappresentativi per i cardiomiociti isolati meccanicamente da campioni di miocardio freschi (“freschi”) e congelati (“congelati”) e dal cuore digerito della collagenasi (tecnica di Langgendorf modificata) con permeabilizzazione posteriore con Tritone (“Collag+Triton”). Valori di (A) Tensione totale, (B) Tensione attiva e (C) Tensione pasisve da cardiomiociti attivati con soluzione pCa 4.5 ad una lunghezza del sarcomero di ≈2,2 μm. (D) Curva di sensibilità al calcio e i rispettivi valori per (E) pCa50 e (F) nHill. (G) Valori di forza residua e (H) ktr calcolati alla soluzione massima di attivazione (pCa 4.5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. File supplementare. Clicca qui per scaricare questo file. Negozio su Soluzioni stock [M] Volume finale (mL) Peso/volume Note 4°C Idrossido di potassio (KOH) 1 100 5.611 g Per regolare il pH 4°C Idrossido di potassio (KOH) 5 50 14,03 g Per regolare il pH 4°C Bes 1 50 10,66 g 4°C Acido propionico 1 100 7.483 mL Regolare il pH a 7.0 con 5M o 1M KOH 4°C CaEGTA composta da: 0.1 100 Mescolare e riscaldare la soluzione a 60°C per più di 1 ora. Regolare il pH a 5-6 con 1M KOH. – CaCO3 0.1 1.001 g – Titriplex (EGTA) 0.1 3.804 Tabella 1: Istruzioni per la preparazione delle soluzioni stock. RELAX-ISO (per l’isolamento dei cardiomiociti) [mM] Peso Na2ATP 5.95 3,28 g MgCl2.6H2O 6.04 1,23 g Tritiplex (EGTA) 2 0,76 g Kcl 139.6 10,41 g Imidazolo 10 0,68 g Tabella 2: Istruzioni per la preparazione della soluzione Relax-ISO. Soluzione attivante (per le misure) [mM] Peso/volume Na2ATP 5.97 0,823 g MgCl 1M 6.28 1,57 mL Acido propionico 40.64 10,16 mL Bes 100 25 mL CaEGTA (soluzione stock precedentemente preparata) 7 17,5 mL Na2PCr 14.5 0,925 g Tabella 3: Istruzioni per l’attivazione della preparazione della soluzione. Soluzione rilassante (per le misure) [mM] Peso/volume Na2ATP 5.89 0,325 g MgCl 1M 6.48 0,65 mL Acido propionico 40.76 4,08 mL Bes 100 10 mL Titriplex (EGTA) 6.97 0,265 g Na2PCr 14.5 0,370 g Tabella 4: Istruzioni per una preparazione rilassante della soluzione. pCa = -Log [Ca2+] Rilassante (pCa=9.0)Ml Accattivante (pCa=4,5)Ml 5 0.86 39.14 5.1 1.2 38.80 5.2 1.54 38.46 5.3 2 38.00 5.4 2.51 37.49 5.5 3.14 36.86 5.6 3.89 36.11 5.7 4.8 35.20 5.8 5.89 34.11 5.9 7.14 32.86 6 8.57 31.43 Tabella 5: Istruzioni per la preparazione delle soluzioni pCa. Parametro Roditore Maiale Umano Tensione attiva, kN.m-2 (a 2,2 μm) 17 – 28 19 – 40 19 – 36 Tensione passiva, kN.m-2 (a 2,2 μm) 3.6 – 5.5 1.9 – 6.8 1.8 – 2.3 pCa50 5.58 – 5.64 5.40 – 5.50 5.43 – 5.82 nCellino 2.60 – 2.76 2.95 – 3.36 2.99 – 3.10 ktr, s-1 4.00 – 8.00 1.00 – 3.00 0.90 – 2.00 Tabella 6: Parametri e indici tipici derivati da singoli cardiomiociti permeabili da roditori, suini e umani. Adattato da12. Problema Possibile motivo Soluzione Il cardiomiocita si stacca durante l’attivazione massima Tempo di incollaggio insufficiente; La colla è vecchia e si è asciugata Aumentare il tempo della fase di incollaggio; prendere in considerazione l’apertura di un nuovo tubo di colla. C’è Triton® nella soluzione di sospensione cellulare, che non può più essere rimossa Ripetere la procedura di estrazione con uno o due tritoni ® i passaggi di lavaggio Il cardiomiocita ha una bassa forza in condizioni di controllo L’estrazione è andata male e ha consegnato celle di bassa qualità Aumentare le dimensioni del campione e fare una nuova estrazione. Se il problema persiste è probabilmente dovuto a una raccolta di campioni non corretta, eliminare questo esempio La cellula si sta visibilmente contraendo ma non viene registrata alcuna forza; La cella ha valori di forza insoliti Il trasduttore di forza è spento Accendilo Il trasduttore di forza non è ben calibrato Calibrare il trasduttore di forza utilizzando una serie di pesi noti (controllare il manuale di istruzioni del produttore). L’ago del trasduttore di forza è allentato Incollare di nuovo l’ago usando legame di cristallo 509 o cera gioiellieri. Il modello di striation non è abbastanza buono per determinare la lunghezza del sarcomero Luce insufficiente Aumentare la luce del microscopio o spostare la cella di nuovo sul coverslip e valutare nuovamente la lunghezza del sarcomero (i pozzi hanno un’intensità luminosa inferiore) L’estrazione è andata male e ha consegnato celle di bassa qualità Aumentare le dimensioni del campione e fare una nuova estrazione Le punte degli aghi non sono sullo stesso piano Utilizzando micromanipolatori, regolare le punte degli aghi su o giù fino a trovare un sarcomere focalizzato Nessuna variazione di lunghezza e/o forza durante l’acquisizione Il motore o il trasduttore di forza sono spenti Accendili Il motore è rotto e non produce accorciamento cellulare Sostituirlo o provare a calibrarlo utilizzando un generatore di funzioni Troppo rumore sulle registrazioni di acquisizione Troppo flusso d’aria intorno all’apparecchiatura Proteggere l’apparecchiatura dal flusso d’aria diretto Troppe vibrazioni intorno all’apparecchiatura Si consiglia una tabella di stabilizzazione. Anche allora, si consiglia di rimuovere qualsiasi apparecchiatura che potrebbe avere un compressore o emettere vibrazioni (congelatore, frigoriferi) La curva di sensibilità ca2+ha valori strani e i valori di forza non aumentano con [Ca2+]. La miscela di soluzione attivante e rilassante non è stata eseguita correttamente (controllare da 3.10 a 3.14 della sezione metodi, probabilmente a causa di una miscelazione insufficiente) Scongelare le fiale con la stessa concentrazione, raccogliere tutto il contenuto di fiala nello stesso becher, mescolare con un agitatore e dividerli di nuovo. Testare nuovamente queste soluzioni in una nuova cella. Se questo risolve il problema, preparare un nuovo lotto di soluzioni contenenti Ca2+ Tabella 7: Tabella dei problemi.

Discussion

La valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati rappresenta una tecnica importante per chiarire le modifiche che si verificano a livello di cardiomiociti in contesto fisiologico (ad esempio, stretch) e patologico (ad esempio, ischemia). Questa metodologia ha diversi vantaggi come richiedere una quantità minima di miocardio per valutare la funzione nei cardiomiociti ottenuti da campioni scongelati; utilizzando cardiomiociti provenienti da una vasta gamma di specie(topi 13,ratti 1,14,15,coniglio 16,maiale17,cane18,cavia19 eumani 20)e diverse località cardiache, tra cui gli atri, ventricoli sinistro e destro o una regione specifica del cuore infarto. Inoltre, questa tecnica consente di fornire concentrazioni specifiche di Ca2+ ed energia (ATP) misurando al contempo la funzione delle strutture normative e contrattili nella loro configurazione nativa.

Nonostante la semplicità di questa tecnica, ci sono alcuni passaggi critici. È essenziale garantire la qualità di ogni fase fin dall’inizio, compresa la raccolta dei campioni. Le proteine del miofilamento sono suscettibili alle proteasi21. Pertanto è obbligatorio conservare campioni in azoto liquido immediatamente dopo la sua raccolta. I campioni freschi, che non erano precedentemente congelati, svilupperanno forze significativamente più elevate, quindi non è consigliabile mescolare la misurazione eseguita in campioni freschi e congelati nello stesso protocollo. Il secondo passo più critico è l’estrazione dei cardiomiociti. Durante questa procedura, è fondamentale mantenere il campione sul ghiaccio per la maggior parte del tempo. Un cocktail inibitore della proteasi può essere utilizzato per ridurre il rischio di degradazione proteica durante l’estrazione / permeabilizzazione22. In terzo luogo, i campioni dovrebbero essere tagliati in pezzi più piccoli utilizzando precisi movimenti del bisturi poiché abbiamo notato cardiomiociti di qualità ridotta quando questo passaggio è stato ignorato. Un altro passo critico è lavare i cardiomiociti poiché è difficile avere il giusto equilibrio tra lavare Tritone (permeabilizza la cellula ma ne favorisce lo scollatura) e mantenere il maggior numero possibile di cellule nel supernatante. È importante provare prima l’estrazione e il numero di lavaggi per ogni campione, specie o protocollo. Ad esempio, nelle nostre mani, abbiamo notato che le estrazioni di tessuti di ratto obesi ZSF1 hanno un aspetto “grasso”, che ha reso queste cellule più scivolose durante l’incollaggio ma non più difficili da misurare. Il modo in cui eludiamo questo problema è stato eseguendo più esperimenti per avere un numero ragionevole di cellule per animale. Inoltre, è fondamentale selezionare una buona cella da incollare, vale a dire con una buona striatura e una lunghezza ragionevole. Se il cardiomiocita non ha queste caratteristiche, si stacca principalmente dalle punte dell’ago o non sviluppa alcuna / bassa forza. È anche importante utilizzare la colla corretta per l’attacco di cardiomiociti, considerando il tempo di incollaggio e la sua efficacia per incollare la cellula all’ago. Nelle nostre mani, la colla siliconica(Tavolo dei Materiali)si polimerizza velocemente (10-15 min) e abbastanza forte. Infine, l’ultimo passaggio critico è correlato al sollevamento attento del cardiomiocita 5 min dopo aver incollato la cellula (per evitare di incollare la cella al coverslip) e prima di spostarla nei pozzi (per evitare che la cellula venga trascinata dallo stadio del microscopio). La tabella 7 riassume la risoluzione dei problemi associati a questa tecnica, le sue cause di fondo e le possibili soluzioni per superare i problemi frequenti.

La principale limitazione di questo metodo è che non può rispondere a tutte le domande relative alla contrattilità del miofilamento, come la velocità di attivazione/disattivazione dei miofilamenti. Nell’ambiente in vivo, la depolarizzazione della membrana, l’aumento intracellulare ca2+ e la sua diffusione nei miofilamenti devono verificarsi affinché i miociti si contrarranno, mentre nei cardiomiociti scuoiati la diffusione ca2+ ai miofilamenti avviene immediatamente quando la cellula è immersa nella soluzione Ca2+. Questa velocità più veloce di diffusione di Ca2+ indirà l’analisi di attivazione/disattivazione dei miofilamenti23.

Questi esperimenti sono influenzati da diversi fattori, tra cui la temperatura, il pH della soluzione, la perturbazione meccanica (slack-re-stretch vs. slack) e le procedure di fissaggio cellulare (pin tie vs glue), tutte queste variabili che rappresentano discrepanze di letteratura in termini di ktr e l’aumento dipendente dalla lunghezza del sarcomero in forza4,12.

Il progresso futuro della tecnica include l’esecuzione di studi funzionali in cardiomiociti intatti piuttosto che permeabilizzati. Questa tecnica ha lo svantaggio di affidarsi a cardiomiociti appena isolati (non precedentemente congelati). Un’altra questione importante non direttamente correlata a questa metodologia, ma che può avere un impatto significativo, è correlata al periodo massimo di stoccaggio congelato del campione. Nello specifico, è obbligatorio stabilire il grado di degradazione del miofilamento per tutto il tempo di conservazione (cioè, per quanto tempo i campioni congelati possono essere conservati al fine di garantire dati funzionali di buona qualità derivati dai cardiomiociti estratti).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), l’Unione europea, il Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), il Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e la Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) per il finanziamento dell’unità di ricerca UnIC (UID/IC/00051/2013). Questo progetto è sostenuto da FEDER attraverso COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), il progetto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), sostenuto dal programma operativo regionale Norte Portugal (NORTE 2020), nell’ambito dell’accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), il progetto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), sostenuto dai Fondi strutturali e di investimento europei, il programma operativo regionale di Lisbona 2020. Patrícia Rodrigues è stata finanziata da FCT (SFRH/BD/96026/2013) e João Almeida-Coelho è stata da Universidade do Porto/FMUP e FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Materials

Acetone Sigma 34580
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) Sigma A2383
Calcium carbonate (CaCO3) Merck 1.02067.0500
Imidazole VWR 24720.157
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) Merck 1.05833.0250
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) Sigma M1028
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) Sigma B9879
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) Sigma P7936
Potassium chloride (KCl) Merck 1.04936.1000
Potassium hydroxide (KOH) Merck 8.14353.1000
Propionic acid (C3H6O2) Merck 8.00605.0500
Silicone Squeeze Tube Marineland 31003
Tritiplex (EGTA) Merck 1.08435.0025
Triton® X-100 10% Merck 648463
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) Terre Haute Glas-col
Length Controller ( Model 315C-I) Aurora Scientific
Force Transducer (Model 403 A) Aurora Scientific
Software ASI 600A Aurora Scientific
Sotware VSL (Model 900B) Aurora Scientific
Inverted Microscope (IX51) Olympus
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References

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Gonçalves-Rodrigues, P., Almeida-Coelho, J., Gonçalves, A., Amorim, F., Leite-Moreira, A. F., Stienen, G. J., Falcão-Pires, I. In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (160), e60427, doi:10.3791/60427 (2020).
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