Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme
Summary
Bu yöntem, r26R-Konfeti (Konfeti) fare modelinin mineralize dokuları incelemek için kullanımını açıklar ve üreme stratejisinden görüntü edinimiiçin tüm adımları kapsamaktadır. Dahil tüm yumuşak dokulara uygulanabilir genel bir protokol ve mineralize dokulara uygulanabilir değiştirilmiş bir protokoldür.
Abstract
Hangi hücre türlerine yol açabileceğini izlemek ve organizma üzerinden göçünü izlemek ya da uzun ömürlülüğünü belirlemek için vücuttaki tek bir hücreyi etiketlemek doku geliştirme ve bakım mekanizmalarını ortaya çıkarmak için güçlü bir yol olabilir. In vivo hücreleri izlemek için mevcut en önemli araçlardan biri Konfeti fare modelidir. Konfeti modeli, hücre tipine özgü çeşitli floresan proteinlere sahip canlı farelerdeki tek tek hücreleri genetik olarak etiketlemek ve onların kaderini ve zaman içinde nesillerinin kaderini klonal genetik izleme adı verilen bir süreçte izleyebilir veya klonal soy izleme. Bu model neredeyse on yıl önce oluşturuldu ve özellikle kök hücre biyolojisi, gelişimi ve yetişkin dokularının yenilenmesi ile ilgili birçok biyolojik sürecin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak, görüntü toplama ve çeşitli floresan sinyalleri eşzamanlı yakalama kadar floresan sinyali korumak teknik olarak zor, mineralize doku için özellikle. Bu yayın, herhangi bir mineralize veya mineralize olmayan dokuya uygulanabilir büyüme plaka kıkırdağı analiz etmek için Konfeti modeli kullanmak için bir adım adım protokol açıklar.
Introduction
Hücre davranışını izlemek için geliştirilmiş yöntemler hayvan modelleri kullanırken deneysel verimliliği artırmak için arzu edilir. Vivo hücre davranışını izlemek için en bilgilendirici yaklaşımlardan biri çok renkli muhabir fare suşları ile klonal soy izleme1, yaygın olarak kullanılan R26R-Konfeti dahil (Konfeti) fare2. Genetik olarak floresan proteinler ile tek tek hücreleri etiketleme ve zaman içinde bu hücreleri takip ederek, birçok alanda araştırmacılar farklı biyolojik sistemlerin çok sayıda içine anlayışlar ortaya konfeti fare kullandık.
Konfeti fare, Cre bağımlı DNA rekombinasyon bir stokastik şekilde birkaç olası floresan proteinlerin kalıcı ifade neden olduğu bir loxP tabanlı muhabirsistemidir 2. R26R-Konfeti alel her yerde ifade CAGG organizatörü içerir, hangi bir loxP-kanatlı NeoR-kaset hemen upstream yatıyor2, olan poliadenilasyon sırası transkripsiyon sona erer3, takip Brainbow 2.1 yapı4. Bu nedenle, Cre aracılı rekombinasyon aynı anda NeoR-kaseti uyarır ve Brainbow 2.1 yapısının hangi kısımlarının eksiretlendiğine bağlı olarak bazı floresan proteinlerin üretimine yol açar. Bu özellik Konfeti fareyi son derece uyarlanabilir hale getirir, çünkü belirli bir Cre türünün kullanılabildiği bir faredeki herhangi bir hücresel popülasyonu hedeflemek için kullanılabilir. R26R-Konfeti suşu ile dokuya özgü cre suşunun geçişi etiketlemenin özgüllüğünü sağlar. Ancak, Cre suşu da indüklenebilir olmalıdır (örneğin, CreERT veya CreERT2, onları çekirdek girmek ve DNA rekombinasyon neden izin vermek için tamoksifen bağlanması gerektiren5)böylece etiketleme belirtilen zaman noktalarında elde edilebilir. Böylece, hücresel popülasyon, elde edilen CreERT-pozitif/Konfeti pozitif yavrulara istenilen zaman noktasında tamoksifen enjekte edilerek etiketlenebilir ve ilgi dokularının analiz için toplanabileceği belirli bir yaşa kadar izlenebilir. Doku işleme den sonra, floresan etiketli hücreler konfokal mikroskopi ile doğrudan görüntülenebilir, böylece başlangıçta etiketlenmiş her hücrenin soyundan ayrılabilmek için, kendi özel floresanlarına göre başka bir etiketli hücre tarafından oluşturulan dölden ayrılabilir. etiketler, böylece klonalitenin değerlendirilmesine izin verir (yani, klonal genetik izleme).
Konfeti modelinin esnekliği nedeniyle, sağlık ve hastalık2,6,7,8,9birçok farklı dokuların geliştirilmesi ve bakımı çalışması için uygulanmıştır , 10,11. Modeli kullanmanın yaygın bir yolu, belirli bir hücre popülasyonunu etiketlemek ve hangi dokulara (ve/veya soylarının) katkıda bulunduğunu belirlemektir. Bu yaklaşımı kullanarak böyle bir bulgu yetişkin diş glial kökenli hücrelerden oluşur oldu6. Modelin bir diğer uygulaması kök hücre homeostazçalışmasıdır. Örneğin, Konfeti modeli bazı kök hücre klonları kökhücre2 arasındaki rekabet sırasında baskın olduğu için bağırsak mahzenlerinde kök hücre nişleri yavaş yavaş monoklonal hale ortaya koymuştur . Model aynı zamanda hücre çoğalmasını değerlendirmek için de kullanılabilir, hangi özellikle yavaş yavaş hücreleri bölen çalışma için yararlıdır. Örneğin, eklem kıkırdağı12 klonal oluşumu değerlendirildi ve beş haftalık farelerde büyüme plaka kondrositler üzerinde bir kirpi antagonisti kısa vadeli etkileri13çalışıldı .
Konfeti modelinin göreceli basitliğine rağmen, floresan sinyal, özellikle mineralize dokuları analiz ederken, görüntü koleksiyonuna kadar korumak için teknik olarak zor olabilir. Burada protokol, konfeti fareyi doğum sonrası kemikle (6 aya kadar) kullanmak için optimize edilmiş bir modeli tanımlayarak floresan proteinlerin immünoalgılamaya gerek kalmadan konfokal mikroskopi ile doğrudan görüntülemesini sağlar. Bu basitleştirilmiş protokol mineralsiz dokulara uygulanabilir. Ayrıca, en az 3 yıl uzun bir süre için floresan sinyali korumak için örnekleri saklamak için nasıl bir açıklama dahildir. Protokolün anahatları Şekil 1’desunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konfeti modeli mineralize kıkırdak dokuları12,13,14 ve optimize protokol tanımlamak için kapsamlı olarak kullanılmıştır. R26R-Konfeti alelinin bir veya iki kopyası na sahip konfeti fareler2, üreme ve deneyler için kullanılabilir. Brainbow 2.1 yapısının bir aleline sahip farelerde rekombinasyon dört potansiyel etiket verecektir: kırmızı floresan protein (RFP, sitoplazmik), sarı floresan protein (YFP, sitoplazmik), siyan floresan protein (CFP, membran lokalize) ve yeşil floresan protein (GFP, çekirdek-lokalize), homozigot Konfeti farelerde rekombinasyon ise (yani, Brainbow 2.1 yapısının iki kopyasını içeren) 10 olası renk çıkışı verecektir (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+CFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). Ancak, DNA eksizyonu ve inversiyon olayları stochastic bir şekilde meydana çünkü, GFP üretmek için rekombinasyon hücrelerin sadece küçük bir kısmını oluşur, daha önce bildirilen2, ve görünüşte hücre tipi veya Cre hattı ile değişir2, 12,13. Bu nedenle, GFP ekspresyonuna yol açan rekombinasyon olaylarının düşük oluşumu göz önüne alındığında, altı renk çıkışları homozigot Konfeti farelerde en yaygın olanıdır.
Konfeti fare ile deneyler planlarken önemli bir husus uygun bir Cre zorlanma bulmaktır. Birincisi, Konfeti alel birkaç loxP siteleri olduğundan, bir rekombinasyon olay ikinci bir4engel değildir . Bu, bir hücre etiketlenir ve bir renk klonunu oluşturmak için bölünürse, kız hücrelerinden birinde ikinci bir yeniden birleşim olayı farklı bir renk oluşturarak gerçek klonal genişlemeyi maskeleyeceği anlamına gelir. Bu nedenle, ilgili organizatör aktif ise enzim her zaman aktif olduğu noninducible Cre suşları, tavsiye edilmez. İkinci olarak, bazı suşlarda Cre rekombinaz ın ekspresyonu genellikle endojen bir proteinpahasına gelir, böylelikle kendi fenotipini oluşturur (örneğin, farelerin iki Cre alel15barındırdığı Prg4-GFPCreERT2 knock-in fare suşuiçin), Bu yüzden Cre alel tek bir kopyası arzu edilir. Açıklanan deneylerin tümlerinde, Col2CreERT16’nın tek bir kopyası,13’teaçıklandığı gibi, Col2CreERT:Konfeti fareleri oluşturmak için erkek veya dişi ebeveyn tarafından taşınmıştır. Daha sonra, Cre satırının ilgi hücre türüne özgüllüğü önemli bir husustur. Örneğin, Col2CreERT kondrosit özgüdür, ancak erken doğum sonrası kıkırdak17kondrosit birkaç farklı popülasyonları etiketler. Son olarak, farklı Cre suşlarının aktivitesi hayvan yaşı ile önemli ölçüde değişebilir, cre ifade değişiklikleri için kullanılan organizatörün endojen aktivitesi olarak, aynı tip hücrelerde bile (örneğin, Prg4-GFPCreERT2, artan bir gerektirebilir fareler yaş15olarak yüzeysel bölge hücrelerini etiketlemek için tamoksifen dozlarının sayısı.
Etiketli hücrelerin sayısı verilen tamoksifen miktarı ile yansıtılacaktır, bu yüzden her zaman birbirinden klonlar ayırt zor olabilir, çünkü maksimum doz vermek için arzu edilmez. Cre ifade farklı organizatörlerin düzenlenmesi altında yanı sıra yaş ile değişir çünkü, tamoksifen doz etiketleme optimize etmek için ayarlanması gerekecektir. Rekombinasyon için zaman gerekli olduğundan ve ortaya çıkan floresan proteinlerin görüntüleme için yeterli birikmesi gerektiğinden, hücrelerin rekombinasyon tetikleme üzerine hemen floresan olmadığını belirtmek önemlidir. Cre hattı, hücre tipi ve hayvan yaşı etkilenmiş gibi görünen geniş bir saat aralığı (24−72 saat arasında) gereklidir. Tamoksifen18 uygulamadan uzun süre sonra biyolojik olarak aktif olabileceğinden her modelde rekombinasyon verimliliğini iyice kontrol etmek tavsiye edilir.
Konfokal mikroskopi adımı sırasında Konfeti floresan proteinlerin uyarılması, lazer ışığı ile dokunun penetrasyonunu gerektirir. Farklı dokular farklı özelliklere sahip olduğundan, lazer ışığı tüm dokuların 160 μm kalınlığındaki bölümlerine nüfuz edemeyebilir. Ancak, şekil 2, Şekil 3’tekullanıldığı gibi, bu kalın kesitler büyüme plakakık kıkırdağı için kullanılabilir. Her mikroskopun farklı olduğunu ve açıklanan ayarların(Ek Dosya 1)küçük ayarlamalar olmadan mükemmel bir şekilde çalışmasının olası olmadığını unutmayın. En büyük zorluklardan biri, bir kanaldan diğerine kontaminasyon olmamasını sağlamak için farklı floresan proteinleri ayırt etmektir. Örneğin, GFP’den gelen floresan nedeniyle YFP kanalındaki sinyal YFP ve RFP kanalları arasında çakışıyor. YFP ve CFP kanalları da dikkatle kontrol edilmelidir. Bu çeşitli şekillerde yapılabilir. İlk olarak, her floresan protein için kaydedilen floresan ışık dalga boylarının emisyon aralığı daraltılabilir. İkinci olarak, lazer gücünü dijital kazançla birlikte ayarlamak sinyali optimize edebilir. Bu çalışmada bu adımlar yeterli, ancak güçlü bir floresan sinyali güveniyor. Bu teoride, verimsiz doku işleme floresan proteinlerin aktivitesini azaltabilir, ya da zayıf bir lazer ışık kaynağı kanal ayırma bozabilir anlamına gelir.
Konfeti farenin avantajlarından biri, belirli genlerin klonal dinamikler üzerindeki etkisinin 10,11,12’yekadar kullanılabilen çok sayıda genetik mutant suşları ile kombine edilebilmeleridir. ,13,14,19,20, bazı sınırlamalar olsa. Örneğin, Konfeti alellerinin rekombinasyonu ve ilgi geni Cre loxP tabanlı mutantlar klonal soy takibi ile birlikte yken ayrılamaz. Yine de, bu tür çakışan rekombinasyon olayları etkili olabilir10,14,20. Örneğin, bu olasılık, büyümeplakası 21’de TSC1’in doğum sonrası kondrosit spesifik ablasyonunu takiben farelerin dinlenme bölgesinde artan hücre sayısını araştırmak için kullanıldı ve zaman içinde bu hücreler arasındaki klonal ilişkiyi ortaya çıkardı. 13. Ayrıca, Konfeti fareler kullanarak dokuya özgü klonal analiz non-Cre loxP tabanlı mutant fareler ile kullanılabilir11, ve farmakolojik ile bu yaklaşımları birleştirmek mümkündür8,9 ,13 ve/veya cerrahi modeller8 diğer fonksiyonel tedirginliklere klonal yanıtları görselleştirmek için. Konfeti etiketli bölümleri endojen proteinlerin immünofloresan ile immünosiyamı ile birleştirildiğinde daha fazla fırsat ortaya çıkar. Bu tür analizler, izlenen hücrelerin tanımlanmasını ve bilinen bir belirteç le birlikte kolokalizasyonlarını sağlar. Burada açıklanan fiksasyon yöntemi ile, immünfloresans yapmak ve hala Konfeti floresan proteinler12,13floresan görselleştirmek mümkündür. Ancak, bahsedilen kağıtlarda, antijen alımı gerekli değildi. Sert antijen alma yöntemleri, sitrat tampon kaynama gibi, Konfeti floresan tam bir kaybına yol açar. Konfeti floresan proteinler daha sonra antikorlar kullanılarak tespit edilebilir rağmen22, klonal kimlik kaybı oluşabilir.
Özetle, konfeti modelini kullanarak hücreleri in vivo olarak etiketlemek, zaman içinde bu hücrelerin kaderini analiz etmek için bilgilendirici bir araçtır. Açıklanan yöntem, mineralize dokularda floresan protein ekspresyonunu doğrudan görselleştirmek için hızlı ve etkili bir yol sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Evgeny Ivashkin’e metodolojik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi (A.S.C), Rusya Bilimsel Vakfı (ASC’ye #19-15-00241 hibe), Karolinska Enstitüsü (A.S.C.), StratRegen KI ve Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen tarafından finansal olarak desteklenmiştir. Frimurare Barnhuset ve Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Çin Burs Konseyi (B.Z.). Konfokal mikroskop Knut ve Alice Wallenberg Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. 遗传学. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
