מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.
Abstract
דלקת בריאות פולשנית על ידי העובש אספרגייוס , מהווה איום גדול לחולים בסיכון חיסוני. שאפה פטרייתי פטריות (נבגים) נמחקים מן הריאה האנושית מכתשי על ידי להיות phagocytosed על ידי מונוציטים מולדת ו/או נויטרופילים. פרוטוקול זה מציע מדידה מהירה ואמינה של phagocyציטוזה על ידי זרימה cy, באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-מחט המסומנת לשיתוף הדגירה עם לוקיציטים האדם ולאחר הצביעת נגד נוגדנים נגד FITC כדי לאפשר אפליה של הפנפינט ותאי-חסיד המחט. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם מהירות, האפשרות לשלב את הטיפול עם ניתוח ציטומטרי של סמני תאים אחרים של עניין, הניתוח הסימולטני של מונוציטים ונויטרופילים ממדגם אחד את הישימות שלה כדי הקיר אחר הנושאת הפטריות או חיידקים. קביעת אחוזים של לוקיציטים מספקת אמצעי למיקרו-ביולוגים להערכת התקפה אלימה של פתוגן או להשוואת סוגי הפתוגן והמוטציות, כמו גם למחלות אימונולוגים לחקירת יכולות לוקמיה אנושיים כדי להילחם בפתוגנים.
Introduction
הריאות פולשנית הריאתי הוא איום גדול לחולים חיסוני כמו אפשרויות הטיפול מוגבלות ורק מוצלח על אבחנה מוקדמת, אשר מוביל שיעורי תמותה גבוה1. החומרים הזיהומיות הם עצי מחט (נבגים) של העובש אספרגייוס , שנמצאים בכל מקום לבתי הגידולהשניים. המחט משאפים, עוברים דרך דרכי הנשימה והוא יכול לבסוף להיכנס לריאות מכתשי. בבני אדם החיסונית, המחט האלה מנוקה על ידי תאים חיסוניים מולדים כגון מונוציטים או מקרופאגים ו נויטרופילים גרנולוציטים, אשר לקחת (phagocytose) ולעכל את פתוגנים3. Phagocyציטוזה חשוב עבור מיקרו ביולוגים ואימונוולוגים גם כאשר מעוניינים אינטראקציה המארחים-הפתוגן. העימות אומר, כגון דגירה שיתוף של לוקיציטים ו מחט, לעתים קרובות כוללים תיוג של הנבגים על ידי fluorescein או הנגזרת הנגזרות שלה isothiocyanate (FITC). באמצעות מיקרוסקופ, זה פשוט לזהות את המחט פלורסנט הפנפנידיה כדי לקבוע המחט מצורף/חסיד, למרות גישה זו היא מסורבלת מוגבלת מציאותית לכמה מאות תאים4. עם זאת, בזרימה cy, אשר בקלות מאפשר ניתוח של מאות אלפי תאים בתוך דקות, מכתים ההפרש של המחט המגולמת וחסיד הוא חיוני. לכן, פרוטוקולים רבים מסתמכים על טריפה כחול כדי להרוות את הקרינה הפלואורסצנטיתמתוך מחט של 5,6,7,8. גישה נוספת היא לנצל את העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית של אתידיום ברומיד ו fitc לפלוט אדום במקום זריחה ירוקה מ חסיד מחט9,10,11. אם יש נוגדנים מסוימים זמינים, כמו במקרה של חיידקים מסוימים, חלקיקים מאוגדים תא יכול להיות מוכתם באופן ישיר12,13.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקוונטי להעריך phagocyציטוזה של התווית FITC מתויג על ידי האדם לוקיציטים, יחד עם החזקה של נבגים לתאים וחוסר אינטראקציה על ידי העסקת allophycocyanin (APC)-ביחד נוגדן ANTI-fitc. השיטה מאפשרת גם ניתוח הציטוטומטט זרימה בו של סמנים תאים נוספים, כי ניתן ליישם ניתוח נפרד של phagocyציטוזה על ידי מונוציטים ו נויטרופילים מאותה דוגמית.
הפרוטוקול יכול להיות מיושם על אפיון של זנים פטרייתיים (למשל, מינים של אספרגינוס וצורות אחרות מסוג mucorales הציג כאן) ואת המוטציות שלהם14 ו מחקר אימונולוגיים על phagocytes, כגון לוקיציטים מאנשים שנפגעו חיסוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטת הזרמה מהירה של הסייטוטומטל למדוד אינטראקציה של המחט. בעלת מספר רב של לוקיציטים אנושיים מרכזיות שאינן אפשריות בפרוטוקולים מיקרוסקופים משותפים. הדמיה תאים עם מיקרוסקופ באופן ידני לספור הפניהמחט היא מסורבלת יכול להיעשות בצורה מציאותית עבור כמה מאות תאים בלבד. הא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגברת פיה שטיר על סיוע טכני מעולה. מ. פון לילינפלד-Toal הוא נתמך על ידי המרכז לבקרת אלח דם וטיפול (משרד הפדרלי הגרמני של החינוך והבריאות, BMBF, FKZ 01E01002) והנגועים בקמפוס המחקר הגנוסטים (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai ואנג נתמך על ידי בית הספר היינה של תקשורת מיקרוביאלית (דויטשה פורשונגסביסםגיסמייססבאחאי, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
