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医学

Cloruro de vinilo y dieta alta en grasas como modelo de medio ambiente e interacción de la obesidad

Published: January 12, 2020
doi:
10.3791/60351
, , , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 2Hepatobiology and Toxicology Program,University of Louisville, 3Department of Physiology and Pharmacology,West Virginia University, 4Center for Inhalation Toxicology,West Virginia University, 5Department of Pharmacology and Chemical Biology,University of Pittsburgh, 6Pittsburgh Liver Research Center,University of Pittsburgh, 7Department of Medicine, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition,University of Pittsburgh

Summary

El objetivo de este protocolo era desarrollar un modelo murino de exposición tóxica de bajo nivel que no causa lesiones hepáticas manifiestas, sino que exacerba el daño hepático preexistente. Este paradigma recapitula mejor la exposición humana y los cambios sutiles que se producen al exponerse a concentraciones toxicantes que se consideran seguras.

Abstract

El cloruro de vinilo (VC), un contaminante ambiental abundante, causa esteatohepatitis a niveles altos, pero se considera seguro a niveles más bajos. Aunque varios estudios han investigado el papel de la VC como hepatotoxicante directo, el concepto de que VC modifica la sensibilidad del hígado a otros factores, como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) causada por una dieta alta en grasas (HFD) es novedoso. Este protocolo describe un paradigma de exposición para evaluar los efectos de la exposición crónica de bajo nivel al VC. Los ratones se aclimatan a una dieta baja en grasas o alta en grasas una semana antes del comienzo de la exposición a la inhalación y permanecen en estas dietas durante todo el experimento. Los ratones están expuestos a VC (nivel de sub-OSHA: <1 ppm) o aire ambiente en cámaras de inhalación durante 6 horas/día, 5 días/semana, durante un máximo de 12 semanas. Los animales son monitoreados semanalmente para el aumento de peso corporal y el consumo de alimentos. Este modelo de exposición de VC no causa ninguna lesión hepática excesiva solo con inhalación de VC. Sin embargo, la combinación de VC y HFD mejora significativamente la enfermedad hepática. Una ventaja técnica de este modelo de coexposición es la exposición de todo el cuerpo, sin restricciones. Además, las condiciones se asemejan más a una situación humana muy común de una exposición combinada a la VC con la enfermedad del hígado graso no alcohólico subyacente y, por lo tanto, apoyan la novedosa hipótesis de que el VC es un factor de riesgo ambiental para el desarrollo de daño hepático como una complicación de la obesidad (es decir, NAFLD). Este trabajo desafía el paradigma de que los límites actuales de exposición de capital de riesgo (ocupacional y ambiental) son seguros. El uso de este modelo puede arrojar nueva luz y preocupación sobre los riesgos de la exposición a capital de riesgo. Este modelo de lesión hepática inducida por tóxicos se puede utilizar para otros compuestos orgánicos volátiles y para estudiar otras interacciones que pueden afectar el hígado y otros sistemas de órganos.

Introduction

Numerosos tóxicos están presentes en el aire que respiramos a niveles muy bajos. El cloruro de vinilo (VC) es el gas monomérico utilizado por la industria para crear productos plásticos de cloruro de polivinilo (PVC)1. Es un hepatotoxicante ambiental prevalente, carcinógeno conocido, y se clasifica #4 en la lista de prioridad de sustancias peligrosas ATSDR2. Para comprender mejor los efectos tóxicos sobre la salud humana y las interacciones con las comorbilidades existentes, es crucial establecer modelos de exposición que imitan la exposición humana. El interés principal de este grupo es estudiar los efectos hepáticos de la exposición crónica de VC a bajas concentraciones. VC ejerce sus principales efectos sobre el hígado, donde se ha demostrado (a altas concentraciones) para causar esteatosis, y la esteatohepatitis asociada a tóxicos (TASH) con necrosis, fibrosis, cirrosis3,4, así como carcinoma hepatocelular (HCC) y el hemangiosarcoma hepático extremadamente raro5. TASH probablemente ha existido en la población durante décadas, pero permaneció sin caracterizar y poco apreciado por los investigadores4,6. Como resultado de la investigación que demuestra las preocupaciones directas de toxicidad para la exposición a capital de riesgo, la Administración de Seguridad y Salud en el Trabajo (OSHA) redujo el umbral de exposición aceptable a 1 ppm durante un día de trabajo de 8 horas7. Aunque se ha reducido el umbral de exposición, el efecto de esta concentración de VC en la salud humana no está claro7. Además, el efecto de la exposición de VC en las comorbilidades existentes, como la enfermedad hepática, se desconoce en gran medida8. Esta brecha de conocimiento es especialmente importante hoy en día debido a la creciente prevalencia mundial de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Es importante destacar que vca ha demostrado recientemente ser un factor de riesgo independiente para la enfermedad hepática por otras causas13. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo era desarrollar un modelo de inhalación pertinente para la exposición al tóxico ambiental volátil, VC en el contexto de una lesión hepática subyacente, para imitar la exposición humana e identificar posibles, mecanismos novedosos de lesión hepática inducida por VC o mejorada por VC.

La principal vía de exposición de muchos tóxicos y contaminantes ambientales es por inhalación. Una vez inhalado, el compuesto puede entrar en circulación sistémica a través de los pulmones, viajar al hígado, y activarse metabólicamente por enzimas hepáticas antes de ser excretado14,15,16. A menudo son estos metabolitos activos que causan toxicidad y daño dentro del cuerpo. Estudios previos de este grupo y otros han utilizado metabolitos de VC como sustitutos para la exposición al gas VC17,18. Otros grupos han utilizado modelos de inhalación de VC; sin embargo, se implementaron niveles de exposición extremadamente altos (>50 ppm) para inducir toxicidad aguda, lesión hepática grave y desarrollo tumoral19. Aunque estos estudios han proporcionado información y mecanismos cruciales de carcinogenicidad inducida por capital de riesgo, no recapitulan los efectos sutiles y las interacciones complejas con otros factores que contribuyen y, por lo tanto, son menos relevantes para la exposición humana.

El modelo de VC-inhalación más dieta alta en grasas (HFD) descrito aquí (ver Figura 1 para la cronología), es el primer modelo de exposición crónica de VC en dosis bajas (es decir, concentración sub-OSHA), en el que los ratones están expuestos al tóxico en condiciones que imitan mucho más la exposición humana. De hecho, los datos de este modelo recapitularon los resultados observados en seres humanos expuestos a LA VC, como el impacto en las vías metabólicas20,el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial4. Otros modelos de ratón de inhalación, como los modelos21solo para la cabeza y solo la nariz, requieren que el animal sea restringido, causando estrés al animal. Aquí, este método de exposición a todo el cuerpo no requiere inyección ni estrés innecesario para los animales. Los animales tienen acceso ad libitum a alimentos y agua y se colocan dentro de la cámara de inhalación más grande durante un número determinado de horas por día y días por semana. Además, el concepto de que VC modifica la sensibilidad a otro hepatotoxicante es un hallazgo novedoso, demostrado primero por este grupo12 y tiene implicaciones para la exposición de capital de riesgo a concentraciones muy inferiores a las necesarias para la hepatotoxicidad directa.

Este método de exposición por inhalación se puede utilizar para imitar la exposición a una variedad de tóxicos gaseosos, incluidos otros compuestos orgánicos volátiles, presentes en nuestro medio ambiente. De hecho, los compuestos orgánicos volátiles son un gran grupo de tóxicos ambientales y más frecuentes en las zonas industrializadas, lo que resulta en que ciertas poblaciones tienen un mayor riesgo de exposición crónica22. Este protocolo se puede modificar para adaptarse a diferentes preguntas experimentales. La duración y la concentración del compuesto administrado pueden variar. Aunque inicialmente desarrollado para la determinación de la lesión hepática, otros sistemas de órganos pueden y han sido estudiados con este modelo23. Los investigadores que tienen como objetivo estudiar las exposiciones crónicas con animales, pero desean minimizar el estrés animal, deben considerar el uso de este modelo.

Protocol

Todos los experimentos con animales/VC fueron aprobados por el Departamento de Salud Ambiental, la Asociación de Seguridad para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio y los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local. 1. Configuración experimental y aclimatación a dietas purificadas y experimentales Determinar el número total de ratones C56Bl/6J (mínimamente 6 x 8 ratones por grupo).NOTA: Los animales de cada grupo de dieta se subdividirán en grupos de exposición. Asegúrese de tener en cuenta el número total de animales necesarios al planificar el estudio. Identificar y pesar a los animales. Registre estos datos. Cambie las dietas de la comida regular a la dieta con bajo contenido de grasa sofocada (LFD) o alta en grasas (HFD) una semana antes del inicio de los experimentos de inhalación para aclimatar a los ratones a las nuevas dietas (ver Figura 1 para la cronología). Proporcione alimentos y agua ad libitum. Supervise el consumo de alimentos pesando y registrando los alimentos que se deben administrar por jaula, y pesando y registrando el resto de los alimentos en cada día de alimentación. Si aloja 4 ratones por jaula, proporcione 50 g de comida dos veces por semana. Si aloja 5 ratones por jaula, proporcione 60 g de comida dos veces por semana.NOTA: Durante la alimentación de las dietas purificadas, la cantidad de alimentos debe comprobarse todos los días para asegurarse de que los ratones tienen suficientes pellets. Si no hay suficientes pellets, los ratones tienden a ‘acumular’ alimentos y aumentar la ingesta. Además, especialmente la HFD tiende a desmoronarse mucho más que la LFD, causando un efecto similar. Monitorear a los animales durante todo el experimento para garantizar el mantenimiento de la salud animal.NOTA: El aumento de peso semanal y el consumo de alimentos, junto con el monitoreo metabólico se pueden hacer para proporcionar un índice de salud animal en general. 2. Sistema de exposición a la inhalación de cloruro de vinilo NOTA: Existen múltiples sistemas de exposición por inhalación disponibles comercialmente, que van desde la exposición “solo nariz” a la exposición de todo el cuerpo y la exposición manual a los sistemas automatizados. Los datos publicados anteriormente por este grupo se derivaron de un sistema manual de todo el cuerpo12,23,24. En la Figura 2se muestra un diagrama que describe el sistema automatizado de exposición a la inhalación. Asegúrese de que el aire diluyente tanto en las cámaras experimentales como en las de control sea aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) y filtrado por carbón activado, secado y regulado por presión antes de entrar en sus respectivos dispositivos de medición de flujo (controlador de flujo masivo [MFC ]–cámara experimental, rotametro-cámara de control).NOTA: En la cámara de control, el rotametro regula el flujo de aire a los ratones. El aire entra en la parte superior de la cámara, pasa por los ratones, luego se agota debajo de los ratones y pasa a través de un filtro HEPA antes de entrar en la campana química. La temperatura y la humedad relativa (RH) se miden dentro de la cámara. En la cámara experimental, el aire diluyente se mezcla con el aire de un tanque de VC. Ambos flujos se regulan con MFC. La relación de las dos mezclas determina la concentración de VC en la cámara experimental. El VC entra en la parte superior de la cámara de exposición a través de un dispersor con siete chorros que apuntan en diferentes direcciones. El VC pasa por los ratones y luego se agota a través de 12 puertos separados que se colocan debajo del bastidor de la jaula. Este diseño de cámara ha demostrado proporcionar concentraciones homogéneas de tóxicos anteriormente25. Asegúrese de que la presión, la temperatura y la humedad relativa se monitorizan desde el interior de las cámaras experimentales y de control. Confirme que el escape de la cámara se pasa a través de un filtro HEPA, una sonda de CO2 y un filtro de carbón activado antes de entrar en el área de escape de la campana química y que el nivel de CO2 se controla para garantizar que los ratones están recibiendo ventilación aceptable. Utilice el software personalizado para cambiar, supervisar y registrar variables ambientales durante las exposiciones por inhalación.NOTA: Si se utiliza un sistema manual, las variables descritas en los pasos 2.1 a 2.4 deben monitorizarse y calibrarse, cuando sea necesario regularmente durante todo el período de exposición. 3. Configuración previa a la exposición Apague todos los flujos de aire en las cámaras experimentales y de control para la seguridad de los técnicos. Para cada cámara, abra la puerta de la cámara y coloque el material absorbente de la ropa de cama (lado absorbente hacia arriba) en la parte superior de la sartén de excretas. Humedezca el material absorbente para proporcionar un nivel de humedad cómodo (40-60% de humedad relativa) durante todo el período de exposición. Ajuste el nivel de exposición deseado de VC en la cámara. Para las concentraciones límite de sub-OSHA utilice 0.85 ppm de VC. Utilice el control de retroalimentación basado en detectores administrado por software de la entrega de VC a la cámara o utilice ajustes manuales en el sistema.NOTA: Este último enfoque requiere el conocimiento del volumen de la cámara, la frecuencia de actualización de la cámara, el flujo de aire y la tasa de entrega del gas VC del suministro de existencias; estos cálculos deberán validarse y calibrarse posteriormente mediante mediciones de concentraciones de CAPITAL de riesgo en la cámara en estado estacionario12,24. La técnica más común para medir VC en la cámara es mediante análisis cromatográfico de gases de aire de muestra12,24. Las ventajas del enfoque basado en software con respecto a la precisión y precisión de la entrega de VC son claras. Sin embargo, se ha demostrado que el enfoque manual también es preciso y coherente12,24.ADVERTENCIA: VC es un tóxico conocido y carcinógeno a niveles altos. Ejercer el equipo de protección personal adecuado y el manejo del gas mientras enciende y apaga las cámaras. 4. Jaula de exposición y preparación animal Retire los ratones de sus cámaras de alojamiento y colóquelos en las jaulas individuales del estante de jaula de la cámara de inhalación (un estante de jaula para los ratones de control, uno para los ratones expuestos). Aleatorizar la colocación de cada ratón dentro del estante de jaula diariamente para asegurarse de que cada ratón se expone de forma homogénea dentro de la cámara de exposición. Marque el número de cada animal y la posición de colocación de la jaula en el cuaderno de laboratorio. Coloque cada estante de jaula en su cámara respectiva y cierre las puertas de la cámara. 5. Llevar a cabo una exposición Asegúrese de que la válvula del tanque de gas VC esté en posición abierta. Asegúrese de que el flujo de diluyente para la cámara experimental esté ajustado a 25 L/min. Inicie el flujo de diluyente en la cámara experimental. Asegúrese de que el rotametro de la cámara de control esté ajustado a 25 L/min. Asegúrese de que todos los sensores (flujos, temperatura, humedad, presión de la cámara, nivel de CO2) funcionan correctamente y muestran los resultados esperados tanto en las cámaras experimentales como en las de control.NOTA: El flujo de VC se calcula y se establece en función del flujo de diluyente y la concentración de VC deseada. Asegúrese de que a lo largo de la exposición, en la cámara experimental, el tiempo de exposición, el flujo de diluyente, el flujo de VC, la temperatura, la humedad, la presión de la cámara, el nivel deCO2 y la concentración teórica de VC se muestren, grafican y registren. Confirme que la temperatura y la humedad de la cámara de control también se muestran, grafican y registran.NOTA: Si se utiliza un sistema manual, el flujo de VC debe comprobarse y ajustarse, cuando sea necesario, durante todo el período de exposición. Si se produce algún problema durante la exposición, establezca el flujo de VC en cero y aumente el flujo de diluyente a su valor máximo para purgar rápidamente la cámara. Una vez alcanzada la duración de la exposición (es decir, 6 h/día), el software apaga automáticamente el flujo de VC. El temporizador de seguridad de 15 minutos entonces comienza para el tiempo después de la duración para que la cámara experimental despeje el VC. Una vez que sea seguro eliminar los animales, haga clic en el botón Aceptar en el cuadro de diálogo. El sistema dejará de registrar las mediciones en el archivo y la exposición ha terminado.NOTA: Si se utiliza un sistema manual, el usuario debe desactivar manualmente el flujo de VC al final de la duración de la exposición y se debe calcular el tiempo para el aclaramiento de VC al final de la exposición. 6. Después de la exposición Gire el tapón de la válvula del tanque de gas VC a la posición cerrada y apague todos los flujos de aire en la cámara de exposición. Gire el rotametro hasta que no fluya ningún flujo de aire a través de la cámara de control. Retire las puertas de cada cámara para proporcionar ventilación a los ratones. Retire los estantes de la jaula de las cámaras. Bajo una capucha, retire los ratones de sus jaulas de exposición y colóquelos de nuevo en sus jaulas de alojamiento. Transportar a todos los ratones de vuelta a su habitación de alojamiento para la vivienda durante la noche en jaulas regulares. Deseche los residuos de la sartén de excretas en un contenedor de riesgo biológico aprobado por el Departamento de Salud Ambiental y Seguridad (DEHS), ya que estos pueden ser considerados un peligro químico por los servicios institucionales de salud ambiental. Limpie las puertas de la cámara, la bandeja de excretas, el estante de la jaula de exposición y la cámara de exposición para los sistemas experimentales y de control. 7. Validación de la concentración de VC dentro de las cámaras durante la exposición Realizar una medición de la concentración de VC dentro de la cámara experimental a la mitad de cada exposición (3 h). Romper las puntas de vidrio en un tubo detector de VC y un tubo de prerefugio. Conecte el extremo de salida del tubo detector de VC a la bomba del tubo detector. Fije el extremo de flujo del tubo detector de VC al extremo de flujo del tubo de pretor con una pieza corta de tubo. Coloque una pieza corta de tubo en el extremo de flujo del tubo de pretor. Retire un enchufe de uno de los puertos de muestreo que está cerca de la zona de respiración de los ratones. Conecte el tubo desde el extremo de flujo del tubo de prerefugio al puerto de muestreo. Desde la posición completa, extienda el mango del pistón de la bomba del tubo detector a la posición de salida completa. Esto extraerá 100 ml de gas muestreado de la cámara en el tubo detector de VC durante un período de 90 s. Después de esperar los 90 s, empuje el mango de nuevo. Repita el paso 7.4 tres veces más para que un total de 400 ml se tire en el tubo del detector de VC. Retire el tubo del puerto de muestreo de la cámara y vuelva a insertar el enchufe en el puerto. Inspeccione el cambio de color del tubo detector de VC para determinar la concentración de VC dentro de la cámara. Registre la lectura del tubo detector de VC en el cuaderno de laboratorio y compárelo con el valor teórico. Deseche el tubo detector de VC y el tubo de prerefugio en un recipiente adecuado. 8. Terminación del experimento de exposición a la inhalación NOTA: Después del punto de tiempo deseado de exposición, por ejemplo, 6, 8 y/o 12 semanas después del inicio de la exposición por inhalación, los experimentos se están terminando y los animales se eutanasiarán (consulte la figura 1 para la cronología). Ayunar los ratones 4 h antes de la hora de la eutanasia.NOTA: Este procedimiento permite determinar los niveles de glucosa e insulina en sangre en ayunas para el análisis metabólico. Utilice un enfoque de eutanasia consistente con las directrices de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense (AVMA, por sus) , como la anestesia seguida de la exsanguinación. Administrar ketamina/xilazina (100/15 mg/kg) por inyección intraperitoneal a cada ratón para inducir anestesia.NOTA: Evite el pentobarbital sódico como anestésico previo a la eutanasia, ya que la exposición al cloruro de vinilo puede impedir su eficacia. Recoger la sangre de la vena cava inferior en solución de citrato de sodio (final, 0,38%), para prevenir la coagulación de la sangre y para la conservación de la muestra. Retire el hígado y/o cualquier otro órgano deseado. Disseccionar el hígado y las porciones de congelación rápida en nitrógeno líquido, incrustar en medio de muestra congelado, y fijar en 10% de formalina tamponada para la histología. Separe el plasma de la sangre a través de la centrifugación y transfiera el plasma citrado a un tubo adecuado y guárdelo a -80 oC hasta que sea necesario para el análisis. Para evaluar los índices histológicos de lesión hepática, realice la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) con secciones hepáticas incrustadas de formalina de 5 m y obtenga imágenes con un microscopio de campo brillante. Para obtener niveles de transaminasas plasmáticas, realice ensayos cinéticos de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en el plasma citrated utilizando kits disponibles comercialmente.NOTA: Para el control de calidad, las transaminasas plasmáticas para ratones C57Bl/6J deben estar en el rango normal (35-45 UI/L) para el grupo LFD+VC, mientras que los valores deben ser elevados (150 UI/L) para el grupo HFD+VC(Figura 3C).

Representative Results

En el transcurso del experimento, el peso corporal animal y el consumo de alimentos fueron monitoreados semanalmente para asegurar la salud animal y evaluar el metabolismo in vivo. La Figura 3A representa el peso corporal y el consumo de alimentos para un experimento de 12 semanas. El peso corporal se midió una vez por semana y el consumo de alimentos se midió dos veces por semana para todos los grupos. Todos los ratones aumentaron de peso a lo largo del estudio. Mientras que, como era de esperar, los ratones en los grupos de HFD ganaron más peso como los ratones en los grupos de LFD, los ratones expuestos a VC no ganaron más peso que los ratones en el grupo de control respectivo. El consumo de alimentos no fue diferente entre todos los grupos12,24. La Figura 3B representa fotomicrografías representativas de secciones hepáticas manchadas con H&E para el análisis de morfología general. En el grupo LFD, el VC no causó ningún cambio patológico indebido. La alimentación con HFD aumentó significativamente la esteatosis (acumulación de grasa) y la exposición a VC aumentaron este efecto. Por otra parte, la exposición de VC en el grupo de HFD dio lugar a algunos focos inflamatorios12,24. Los niveles de transaminasas plasmáticas (ALT y AST) se midieron como indicadores de daño hepático y un nivel elevado de transaminasas es un indicador de daño hepático. En el grupo LFD, VC no aumentó los niveles de transaminasas. La HFD solo aumentó ligeramente los niveles de transaminasas y, lo que es importante, aumentó significativamente este efecto(Figura 3C)12,24. Se calcularon las relaciones de peso hepático a peso corporal para cada grupo. HFD aumentó significativamente las relaciones de hígado a peso corporal. Sin embargo, VC no aumentó significativamente este efecto(Figura 3D)12. Figura 1: Descripción general del procedimiento del modelo de inhalación. Los ratones se alimentan de las respectivas dietas bajas en grasas (13% grasas saturadas) o altas en grasas (42% grasas saturadas) ad libitum durante 1 semana para aclimatarlas a la dieta purificada. Después de una semana, los ratones se introducen en el régimen de inhalación. Para ello, los ratones se colocan en cámaras de inhalación de todo el cuerpo de última generación para la exposición a una concentración de VC de nivel sub-OSHA de <1 ppm (0,85 ppm a 0,1 ppm) o aire ambiente (control) durante 6 horas/día, 5 días/semana, durante 12 semanas. Durante el procedimiento de inhalación se permite el acceso gratuito a los ratones a alimentos y agua. A las 12 semanas, los ratones se eutanasia natan por la mañana. Este modelo se puede extender a períodos más largos de exposición crónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Diseño de la cámara de inhalación. Se muestra un diagrama de un sistema automatizado de exposición por inhalación que proporciona concentraciones homogéneas de toxicantes. El software personalizado permite al usuario cambiar, monitorear y registrar variables ambientales durante las exposiciones por inhalación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Cloruro de vinilo por sí solo no causa lesiones hepáticas, pero mejora la enfermedad hepática inducida por la dieta. (A) El peso corporal y el consumo de alimentos se supervisan semanalmente. (B) Se muestran fotomicrografías representativas de morfología hepática general por tinción de H&E (magnificación 200x). (C) El plasma citrado se recogió al final del período de exposición y se analizó para la actividad enzimática de las transaminasas como índice de daño hepático. (D) El peso del hígado se determinó en diferentes puntos de tiempo experimentales y se comparó con el peso corporal entero. Los resultados se presentan como lamedia de SEM. a , p < 0,05 en comparación con el control LFD respectivo; b, p < 0,05 en comparación con la ausencia de VC. Tamaño de las muestras por grupo n a 8 x 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este modelo de NAFLD mejorado por VC es un método novedoso para evaluar el efecto de la exposición a capital de riesgo de sub-OSHA en un paradigma de inhalación de todo el cuerpo. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos subhepatotóxicos y sensibilizantes solo por bajos niveles de VC. De hecho, este modelo de coexposición logra una lesión hepática mejorada, elevación de la ALT plasmática y AST e inflamación moderada, mientras que en gran medida no afecta a otros sistemas de órganos, como el corazón, en esta concentración23. Este modelo crónico requiere cámaras de inhalación de todo el cuerpo, pero minimiza las concentraciones de estrés y exposición. Aunque el protocolo presentado aquí es un enfoque basado en software, nuestra experiencia ha demostrado que el enfoque manual es también un método preciso y consistente de exposición12,24. Además, es fácilmente aplicable a múltiples áreas de investigación, incluyendo otros daños en órganos23 causados por la exposición a compuestos orgánicos volátiles22. En particular, este modelo puede parecerse más a la patogénesis de las coexposiciones humanas a los productos químicos ambientales y a las enfermedades subyacentes5.

Para obtener resultados similares, se deben lograr ciertos pasos críticos de optimización del protocolo. Por ejemplo, los investigadores deben establecer que la concentración de VC u otro tóxico dentro de las cámaras está dentro del rango deseado de exposición (es decir, niveles de bajo nivel, sub-OSHA o agudos). Optimizar este paso de la cámara de inhalación es fundamental para un modelo exitoso de la exposición humana de interés. En segundo lugar, también se puede modificar el ajuste de la hora de exposición por día y la duración del experimento. Según los intereses de este grupo, se logró un entorno de exposición ocupacional, y también se estudió un parámetro adicional de la dieta. Sin embargo, las exposiciones ambientales y agudas también pueden modelarse con este protocolo.

Este trabajo desafía el paradigma de que los límites actuales de exposición de capital de riesgo (ocupacional y ambiental) son seguros. De hecho, aunque el límite actual de exposición ALaF para VC es de 1 ppm, este modelo ha demostrado que las concentraciones de VC por debajo de este límite son suficientes para mejorar la lesión hepática causada por la HFD en ratones. Este protocolo permite a los investigadores estudiar y caracterizar un novedoso paradigma de exposición a tóxicos y modelar TASH.

Este es el primer modelo de exposición crónica de VC en dosis bajas. Los trabajos anteriores utilizaban concentraciones de bolo muy altas, exposiciones agudas o metabolitos activos como sustitutos de la exposición a capital de riesgo. Todos estos enfoques disminuyen la relevancia de los hallazgos para la exposición humana. Por lo tanto, este nuevo modelo de interacción TASH-NAFLD proporciona la plataforma necesaria para que los investigadores examinen interacciones complejas de exposición de capital de riesgo de bajo nivel.

Este modelo de lesión hepática inducida por tóxicos se puede utilizar para otros compuestos orgánicos volátiles y también para estudiar otras interacciones que pueden afectar el hígado y otros sistemas de órganos8,22,23. Por otra parte, este modelo ha sido, y puede ser utilizado más, para investigar terapias de intervención y estudios mecánicos en profundidad del modo de acción para este tóxico prevalente24. Como VC es un carcinógeno26conocido,27,28, este paradigma de exposición también se puede modificar para el estudio del cáncer inducido por VC. Otras comorbilidades como la enfermedad hepática alcohólica también pueden mejorarse mediante la co-exposición de VC. Además, sería de interés estudiar diferentes tipos de grasa, como la grasa poliinsaturada18,29,30,o diferentes tipos de carbohidratos31 y su co-exposición con VC en este modelo. De hecho, todos estos factores son conocidos por tener efectos diferenciales en el desarrollo de lesiones hepáticas y pueden desempeñar un papel en la enfermedad hepática inducida por VC.

En conclusión, se trata de un nuevo modelo de inhalación de lesión hepática inducida por tóxicos ambientales y establece un paradigma de exposición para la exposición crónica de capital de riesgo de bajo nivel. La concentración de VC utilizado en este modelo es subhepatotóxica por sí mismo, mientras que mejora la lesión hepática causada por otro factor (HFD) en ratones. Este modelo permitirá a los investigadores estudiar mecanismos e intervenciones para la toxicidad crónica del VC y puede ser útil para estudios traslacionales que examinan a sujetos humanos expuestos y con el mayor riesgo de exposición.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue financiado con premios de los Institutos Nacionales de Salud (K01 DK096042 y R03 DK107912) a Juliane Beier. La investigación también fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM113226 y el Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo de la Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número P50AA024337. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution
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References

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).
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