氯乙烯和高脂肪饮食作为环境与肥胖相互作用的典范

所有动物/VC实验均获得环境卫生部、实验室动物护理评估和认证安全协会的批准，程序由当地机构动物护理和使用委员会批准。 1. 实验性设置和适应纯化、实验饮食 确定C56Bl/6J小鼠的总数（每组最少6~8只小鼠）。注：每个饮食组的动物将进一步细分为接触组。在规划研究时，一定要考虑所需的动物总数。 识别和称量动物。记录这些数据。 在开始吸入实验前一周，将饮食从常规饮食切换到纯低脂肪（LFD）或高脂肪饮食（HFD），使小鼠适应新的饮食（有关时间表如图1所示）。 提供食物和水。通过称重和记录每个笼子提供的食物，并在每个喂食日称重和记录食物的剩余部分，来监测食物的消耗情况。如果每个笼子容纳4只老鼠，每周提供两次50克的食物。如果每个笼子容纳5只老鼠，每周提供两次60克的食物。注：在纯化饮食的喂养过程中，应每天检查食物量，以确保小鼠有足够的颗粒。如果颗粒不足，小鼠往往会”囤积”食物并增加摄入量。此外，特别是HFD往往比LFD崩溃更多，造成类似的效果。 在整个实验中监测动物，确保动物健康得到维护。注：每周体重增加和食物消耗，以及代谢监测可以提供整体动物健康的指数。 2. 氯乙烯吸入暴露系统 注： 市售有多种吸入暴露系统，从”仅鼻子”到”全身”暴露，再到手动暴露，再到自动系统。该小组先前公布的数据来自全身手动系统12、23、24。描述自动吸入暴露系统的图表如图2所示。 在进入各自的流量测量装置（质量流量控制器 +MFC）之前，确保实验室和控制室中的稀释空气为高效颗粒空气 （HEPA） 和活性炭过滤、干燥和压力调节[实验室，旋转计+控制室）。注：在控制室中，旋转计调节小鼠的气流。空气进入腔室的顶部，经过老鼠，然后在小鼠下排出，然后通过HEPA过滤器，然后进入化学罩。温度和相对湿度 （RH） 在造型室内测量。在实验室中，稀释空气与来自VC罐的空气混合。这两种流程都由 MMC 进行监管。两种混合物的比例决定了实验室中VC的浓度。VC 通过分散器进入曝光室的顶部，该分散器带有七个射流，指向不同的方向。VC 通过鼠标，然后通过位于网架下方的 12 个独立端口排出。这个腔室设计已被证明提供同质毒性浓度之前25。 确保从实验室和控制室内监控压力、温度和 RH。 在进入化学罩的排气区域之前，确认腔室排气通过 HEPA 过滤器、CO2探头和活性炭过滤器，并监控 CO2水平以确保小鼠获得可接受的通风。 使用自定义软件在吸入暴露期间更改、监控和记录环境变量。注：如果使用手动系统，应在整个暴露期间定期监控和校准步骤 2.1_2.4 中所述的变量。 3. 曝光前设置 关闭实验和控制室中的所有气流，提高技术人员的安全。 对于每个腔室，打开腔室门，将吸水性床上用品（吸收侧向上）放在排泄锅顶部。湿湿吸水材料，在整个暴露期间提供舒适的湿度水平（40–60% RH）。 在造型室中设置所需的 VC 曝光水平。对于亚OSHA限值，使用0.85 ppm的VC。使用软件管理的、基于检测器的反馈控制将 VC 传递到造型室，或者对系统进行手动调整。注：后一种方法要求了解库存供应中的 VC 气体的腔室体积、腔室刷新率、气流和输送速率;这些计算随后必须通过在稳定状态12、24的腔室中的VC浓度测量进行验证和校准。测量腔室VC的最常见技术是通过对样品空气12、24的气度度分析。在VC交付的准确性和精度方面，软件驱动方法的优点显而易见。然而，已经表明，手动方法也是准确和一致的12，24。注意：VC是一种已知的有毒物质和致癌物质，在高水平。在打开和关闭腔室时，使用适当的个人防护设备并处理气体。 4. 暴露笼和动物制备 将小鼠从其壳体中取出，并将其放入吸入室笼架的单独笼子（控制小鼠的一个笼架，一个用于暴露小鼠的网架）。每天随机化每只鼠标在笼架内的位置，以确保每只鼠标在暴露室中均匀地暴露。在实验室笔记本中标记每个动物的数量和笼子放置位置。 将每个保持架放入其各自的造型室，并关闭造型室门。 5. 进行曝光 确保 VC 油箱的阀处于打开位置。确保实验室的稀释剂流量设置为 25 L/min。 在实验室中启动稀释剂流动。确保控制室上的旋转计设置为 25 L/min。 确保所有传感器（流量、温度、湿度、腔室压力、CO2级别）工作正常，并在实验室和控制室中显示预期结果。注：VC流是根据稀释度流和所需的VC浓度计算和设置的。 确保在整个暴露过程中，在实验室中显示暴露时间、稀释液流、VC流、温度、湿度、腔室压力、CO2水平和理论 VC 浓度，并进行图形和记录。确认控制室的温度和湿度也显示、图形和记录。注：如果使用手动系统，则应在必要时在整个曝光期间检查和调整 VC 流。 如果在曝光过程中出现任何问题，将 VC 流设置为零，并将稀释剂流量增加到其最大值，以快速清除造型室。 一旦达到曝光持续时间（即 6 小时/天），软件将自动关闭 VC 流。然后，15 分钟安全计时器在实验室清除 VC 的持续时间后开始。一旦可以安全地删除动物，请单击对话框中的”确定”按钮。系统将停止记录到文件的测量值，并且曝光结束。注：如果使用手动系统，用户必须在曝光持续时间结束时手动关闭 VC 流，并且必须计算曝光结束时的 VC 间隙时间。 6. 暴露后 将 VC 气罐阀上的止动孔转向关闭位置，并关闭暴露室中的所有气流。转动旋转计，直到没有气流流过控制室。 从每个腔室中取下门，为小鼠提供通风。从腔室中取出保持架。在引擎盖下，将老鼠从暴露的笼子里取出，然后放回它们的笼子里。所有老鼠送回他们的住房室过夜住房在常规的笼子里。 将排泄物锅中的任何废物放入环境健康与安全部 （DEHS） 批准的生物危害容器中，因为这些废物可能被视为机构环境卫生服务机构的化学危害。清洁实验和控制系统的造型室门、排泄物盘、曝光笼架和暴露室。 7. 在暴露期间对腔室内VC浓度的验证 在每次曝光（3小时）中途对实验室内的VC浓度进行测量。 打破 VC 探测器管和预处理管上的玻璃尖端。将 VC 检测管的流出端连接到检测器管泵。使用短管将 VC 检测管的流入端连接到预处理管的流出端。将一小片管子连接到预处理管的流入端。 从靠近小鼠呼吸区的采样端口之一上拔下插头。将油管从预处理管的流入端连接到取样口。 从完全位置，将检测器管泵活塞上的手柄伸出至完全伸出位置。这将在 90 s 的时间段内将 100 mL 的采样气体从腔室拉入 VC 检测管。等待 90 后，将手柄推回。 重复步骤7.4三次，使VC检测管共拉入400 mL。 从造型室的取样口拆下管，然后将插头重新插入端口。检查 VC 检测管的颜色变化，以确定腔室内的 VC 浓度。 在实验室笔记本中记录VC检测管读数，并比较理论值。将 VC 检测管和预处理管处理在合适的容器中。 8. 终止吸入暴露实验 注：在所需的暴露时间点后，例如，6、8 和/或吸入接触开始后 12 周，实验终止，动物将被安乐死（有关时间表如图1 所示）。 在安乐死前4小时快速将小鼠快速体内。注：此程序允许确定腹血糖和胰岛素水平，用于代谢分析。 使用符合美国兽医医学协会 （AVMA） 指南的安乐死方法，例如麻醉后进行外泄。 通过向每只小鼠注射腹内注射，以诱导麻醉，施用氯胺酮/西他津（100/15 mg/kg）。注意：避免五巴比妥钠作为安乐死前的麻醉剂，因为氯乙烯暴露可能会妨碍其有效性。 从劣质的vena卡瓦中收集血液到柠酸钠溶液中（最终，0.38%），以防止血液凝固和保存样品。 切除肝脏和/或任何其他所需的器官。在液氮中分离肝脏和扣冻部分，嵌入冷冻标本培养基中，并固定在10%缓冲形式中，用于成科学。 通过离心将血浆从血液中分离出来，并将Citita转移到合适的管中，并储存在-80°C，直到需要进行分析。 为了评价肝损伤的组织学指标，使用5μM形式-石蜡嵌入肝部分进行血氧林和eosin（H&E）染色，用明场显微镜获取图像。 为了获得血浆转氨酶水平，使用市售试剂盒在锡化血浆上同时执行丙氨酸氨基转移酶（ALT）和阿斯巴氨转移酶（AST）动力学测定。注：对于质量控制，C57Bl/6J小鼠的血浆转氨热剂应处于LFD+VC组的正常范围（35~45 IU/L），而HFD+VC组（图3C）的值应升高（+150 IU/L）。