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医学

Cloruro di vinile e dieta ad alto contenuto di grassi come modello di interazione tra ambiente e obesità

Published: January 12, 2020
doi:
10.3791/60351
, , , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 2Hepatobiology and Toxicology Program,University of Louisville, 3Department of Physiology and Pharmacology,West Virginia University, 4Center for Inhalation Toxicology,West Virginia University, 5Department of Pharmacology and Chemical Biology,University of Pittsburgh, 6Pittsburgh Liver Research Center,University of Pittsburgh, 7Department of Medicine, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition,University of Pittsburgh

Summary

L’obiettivo di questo protocollo era quello di sviluppare un modello murino di esposizione tossica di basso livello che non causa lesioni epatiche palesi, ma piuttosto esacerba danni al fegato preesistenti. Questo paradigma ricapitola meglio l’esposizione umana e i sottili cambiamenti che si verificano dopo l’esposizione a concentrazioni tossiche che sono considerate sicure.

Abstract

Cloruro di vinile (VC), un abbondante contaminante ambientale, provoca steatoepatite ad alti livelli, ma è considerato sicuro a livelli inferiori. Anche se diversi studi hanno studiato il ruolo del VC come epatossico diretto, il concetto che VC modifica la sensibilità del fegato ad altri fattori, come la malattia del fegato grasso non alcoholic (NAFLD) causata dalla dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) è nuovo. Questo protocollo descrive un paradigma di esposizione per valutare gli effetti dell’esposizione cronica di basso livello al VC. I topi sono acclimatati a dieta povera di grassi o ad alto contenuto di grassi una settimana prima dell’inizio dell’esposizione all’inalazione e rimangono su queste diete per tutto l’esperimento. I topi sono esposti a VC (livello sub-OSHA: <1 ppm) o all'aria ambiente nelle camere di inalazione per 6 ore al giorno, 5 giorni/settimana, per un massimo di 12 settimane. Gli animali sono monitorati settimanalmente per l'aumento di peso corporeo e il consumo di cibo. Questo modello di esposizione VC non causa lesioni al fegato sopramorato con inalazione di VC da solo. Tuttavia, la combinazione di VC e HFD migliora significativamente la malattia epatica. Un vantaggio tecnico di questo modello di co-esposizione è l'esposizione a tutto il corpo, senza restrizioni. Inoltre, le condizioni assomigliano più da vicino a una situazione umana molto comune di un'esposizione combinata al VC con la malattia del fegato grasso non alcolico sottostante e quindi sostengono la nuova ipotesi che il VC sia un fattore di rischio ambientale per lo sviluppo di danni al fegato come complicanza dell'obesità (cioè NAFLD). Questo lavoro mette in discussione il paradigma che gli attuali limiti di esposizione di VC (occupazionale e ambientale) sono sicuri. L'uso di questo modello può far luce e preoccupazione sui rischi di esposizione alla VC. Questo modello di lesione epatica indotta da sostanze tossiche può essere utilizzato per altri composti organici volatili e per studiare altre interazioni che possono avere un impatto sul fegato e altri sistemi di organi.

Introduction

Numerosi tossici sono presenti nell’aria che respiriamo a livelli molto bassi. Il cloruro di vinile (VC) è un gas monomerico utilizzato dall’industria per creare prodotti plastici in cloruro polivinile (PVC)1. È un epatotossico ambientale prevalente, noto cancerogeno, ed è classificato #4 nell’ATSDR Hazardous Substance Priority List2. Per comprendere meglio gli effetti tossici sulla salute umana e sulle interazioni con le co-morbidità esistenti, è fondamentale stabilire modelli di esposizione che imitano l’esposizione umana. L’interesse principale di questo gruppo è quello di studiare gli effetti epatici dell’esposizione cronica vc a basse concentrazioni. VC esercita i suoi principali effetti sul fegato, dove è stato dimostrato (ad alte concentrazioni) per causare steatosi, e steatoepatite associata a tossicosi (TASH) con necrosi, fibrosi, cirrosi3,4, così come carcinoma epatico (HCC) e l’emangiosarcomapatiosco5 . TASH è probabilmente esistito nella popolazione per decenni, ma è rimasto non caratterizzato e sottovalutato dagli investigatori4,6. Come risultato di una ricerca che ha dimostrato i problemi di tossicità diretta per l’esposizione alla VC, l’Amministrazione per la sicurezza e la salute sul lavoro (OSHA) ha abbassato la soglia di esposizione accettabile a 1 ppm per un giorno di lavoro di 8 ore7. Anche se la soglia di esposizione è stata abbassata, l’effetto di questa concentrazione di VC sulla salute umana non è chiaro7. Inoltre, l’effetto dell’esposizione al VC sulle comorbilità esistenti, come la malattia epatica, è in gran parte sconosciuto8. Questo divario di conoscenze è particolarmente importante oggi a causa della crescente prevalenza globale della malattia epatica grassa non alcolica (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. È importante sottolineare che VC ha recentemente dimostrato di essere un fattore di rischio indipendente per la malattia epatica da altre cause13. L’obiettivo di questo protocollo era quindi quello di sviluppare un modello di inalazione rilevante per l’esposizione al tossico ambientale volatile, VC nel contesto della lesione epatica sottostante, per imitare l’esposizione umana e identificare potenziali, nuovi meccanismi di lesioni epatiche indotte da VC o VC.

La via principale di esposizione per molti sostanze tossiche e inquinanti ambientali è l’inalazione. Una volta inalato, il composto può entrare nella circolazione sistemica attraverso i polmoni, viaggiare al fegato e diventare attivato metabolicamente dagli enzimi epatici prima di essere espulso14,15,16. Spesso sono questi metaboliti attivi che causano tossicità e danni all’interno del corpo. Studi precedenti di questo gruppo e altri hanno utilizzato metaboliti di VC come surrogati per l’esposizione al gas VC17,18. Altri gruppi hanno utilizzato modelli di inalazione di VC; tuttavia, livelli di esposizione estremamente elevati (>50 ppm) sono stati implementati per indurre tossicità acuta, gravi lesioni epatiche e sviluppo tumorale19. Sebbene questi studi abbiano fornito informazioni e meccanismi cruciali della carcinogenicità indotta da VC, non riassumono gli effetti sottili e le interazioni complesse con altri fattori che contribuiscono e pertanto sono meno rilevanti per l’esposizione umana.

Il modello di dieta VC-inalazione più dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) descritto qui (vedi Figura 1 per la linea temporale), è il primo modello di esposizione cronica a basso dosaggio VC (cioè concentrazione sub-OSHA), in cui i topi sono esposti al tossico in condizioni che imitano l’esposizione umana molto più da vicino. Infatti, i dati di questo modello hanno ricapitolato i risultati osservati negli esseri umani esposti al VC, come l’impatto sulle vie metaboliche20, lo stress ossidativo e la disfunzione mitocondriale4. Altri modelli murini di inalazione, come i modelli solo testa e naso21, richiedono che l’animale sia trattenuto, causando stress all’animale. Qui, questo metodo di esposizione a tutto il corpo non richiede iniezione o stress non necessario per gli animali. Gli animali hanno accesso al libitum ad alimenti e acqua e sono collocati all’interno della camera di inalazione più grande per un determinato numero di ore al giorno e giorni alla settimana. Inoltre, il concetto che la VC modifica la sensibilità verso un altro epatotossico è una scoperta nuova, prima dimostrata da questo gruppo12 e ha implicazioni per l’esposizione di VC a concentrazioni ben al di sotto di quelle necessarie per l’epatotossicità diretta.

Questo metodo di esposizione all’inalazione può essere utilizzato per imitare l’esposizione a una varietà di sostanze tossiche gassose, tra cui altri composti organici volatili, presenti nel nostro ambiente. Infatti, i composti organici volatili sono un grande gruppo di tossici ambientali e più diffusi nelle aree industrializzate, con il risultato che alcune popolazioni sono a più alto rischio di esposizione cronica22. Questo protocollo può essere modificato per soddisfare diverse domande sperimentali. Il periodo di tempo e la concentrazione del composto somministrato possono essere variati. Anche se inizialmente sviluppato per la determinazione delle lesioni epatiche, altri sistemi di organi possono e sono stati studiati con questo modello23. I ricercatori che mirano a studiare le esposizioni croniche con gli animali, ma desiderano ridurre al minimo lo stress degli animali, dovrebbero prendere in considerazione l’utilizzo di questo modello.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali/VC sono stati approvati dal Dipartimento per la Salute Ambientale, dalla Safety Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care e le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale locale per la cura e l’uso degli animali. 1. Configurazione sperimentale e acclimatazione a diete sperimentali purificate Determinare il numero totale di mouse C56Bl/6J (minimo 6-8 topi per gruppo).NOTA: Gli animali di ogni gruppo di dieta saranno ulteriormente suddivisi in gruppi di esposizione. Assicurarsi di tenere conto del numero totale di animali necessari per la pianificazione dello studio. Identificare e pesare gli animali. Registrare questi dati. Cambia le diete da un normale chow a una dieta purificata a basso contenuto di grassi (LFD) o ad alto contenuto di grassi (HFD) una settimana prima dell’inizio degli esperimenti di inalazione per acclimatare i topi alle nuove diete (vedi Figura 1 per la linea temporale). Fornire cibo e acqua al libitum. Monitorare il consumo di cibo pesando e registrando il cibo da dare per gabbia, e pesando e registrando il resto del cibo ad ogni giorno di alimentazione. Se alloggia 4 topi per gabbia, fornire 50 g di cibo due volte a settimana. Se alloggia 5 topi per gabbia, fornire 60 g di cibo due volte a settimana.NOTA: Durante l’alimentazione delle diete purificate, la quantità di cibo deve essere controllata ogni giorno per garantire che i topi abbiano pellet sufficienti. Se non ci sono pellet sufficienti, i topi tendono a “accarecare” il cibo e ad aumentare l’assunzione. Inoltre, in particolare l’HFD tende a sgretolarsi molto più del LFD, causando un effetto simile. Monitorare gli animali durante l’esperimento per garantire che la salute degli animali sia mantenuta.NOTA: L’aumento di peso settimanale e il consumo di cibo, insieme al monitoraggio metabolico possono essere fatti per fornire un indice della salute generale degli animali. 2. Sistema di esposizione all’inalazione di cloruro di vinile NOTA: Sono disponibili più sistemi di esposizione all’inalazione disponibili in commercio, che vanno dall’esposizione “solo naso” all’esposizione “tutto il corpo” e dai sistemi manuali ai sistemi automatizzati. I dati precedentemente pubblicati da questo gruppo sono stati ricavati da un sistema manuale completo12,23,24. Nella figura 2è illustrato un diagramma che descrive il sistema di esposizione automatica all’inalazione. Assicurarsi che l’aria diluente sia nelle camere sperimentali che in quelle di controllo sia aria particolato ad alta efficienza (HEPA) e carbonio attivo filtrato, essiccato e pressione regolato prima di entrare nei rispettivi dispositivi di misurazione del flusso (controllore di flusso di massa [MFC camera sperimentale ] – camera di controllo del rotametro).NOTA: Nella camera di controllo, il rotametro regola il flusso d’aria ai topi. L’aria entra nella parte superiore della camera, passa dai topi, quindi viene esaurita sotto i topi e passata attraverso un filtro HEPA prima di entrare nel cofano chimico. La temperatura e l’umidità relativa (RH) sono misurate all’interno della camera. Nella camera sperimentale, l’aria diluente viene mescolata con aria da un serbatoio VC. Entrambi i flussi sono regolati con MFC. Il rapporto tra le due miscele determina la concentrazione di VC nella camera sperimentale. Il VC entra nella parte superiore della camera di esposizione attraverso un dispersore con sette getti che puntano in direzioni diverse. Il VC passa dai topi e viene quindi esaurito attraverso 12 porte separate che sono posizionate sotto il rack gabbia. Questo disegno della camera ha dimostrato di fornire concentrazioni tossiche omogenee in precedenza25. Assicurarsi che la pressione, la temperatura e la RH siano monitorate dall’interno delle camere sperimentali e di controllo. Verificare che lo scarico della camera venga passato attraverso un filtro HEPA, una sonda CO2 e un filtro di carbonio attivato prima di entrare nell’area di scarico del cofano chimico e che il livello di CO2 sia monitorato per garantire che i topi ricevano una ventilazione accettabile. Utilizzare il software personalizzato per modificare, monitorare e registrare le variabili ambientali durante le esposizioni all’inalazione.NOTA: Se si utilizza un sistema manuale, le variabili descritte nei passaggi 2.1.2.4 devono essere monitorate e calibrate, se necessario regolarmente per tutto il periodo di esposizione. 3. Impostazione pre-esposizione Spegnere tutti i flussi d’aria nelle camere di controllo e di controllo per la sicurezza dei tecnici. Per ogni camera, aprire la porta della camera e posizionare il materiale assorbente (lato assorbente verso l’alto) sulla parte superiore della padella di escrezione. Sorbente il materiale assorbente per fornire un livello di umidità confortevole (40-60% RH) per tutto il periodo di esposizione. Impostare il livello di esposizione desiderato di VC nella camera. Per le concentrazioni limite sub-OSHA utilizzare 0,85 ppm di VC. Utilizzare il controllo del feedback della consegna VC alla camera gestito dal software o utilizzare regolazioni manuali del sistema.NOTA: Quest’ultimo approccio richiede la conoscenza del volume della camera, della frequenza di aggiornamento della camera, del flusso d’aria e della velocità di consegna del gas VC dalla fornitura di scorte; questi calcoli devono essere successivamente convalidati e calibrati mediante misurazioni delle concentrazioni di VC nella camera allo stato costante12,24. La tecnica più comune per misurare VC nella camera è tramite l’analisi cromatografica a gas dell’aria campione12,24. I vantaggi dell’approccio basato sul software per quanto riguarda l’accuratezza e la precisione della distribuzione VC sono chiari. Tuttavia, è stato dimostrato che l’approccio manuale è anche accurato e coerente12,24.AMMONIEnte: VC è un tossico e cancerogeno noto ad alti livelli. Esercitare un’adeguata attrezzatura protettiva personale e la manipolazione del gas mentre si accendono e spengono le camere. 4. Gabbia di esposizione e preparazione animale Rimuovere i topi dalle loro camere di alloggio e metterli nelle singole gabbie del rack gabbia camera di inalazione (un rack gabbia per i topi di controllo, uno per i topi esposti). Randomizzare la posizione di ogni topo all’interno del rack della gabbia ogni giorno per garantire che ogni topo sia esposto in modo omogeneo all’interno della camera di esposizione. Contrassegnare il numero di ogni animale e la posizione di posizionamento della gabbia nel taccuino di laboratorio. Posizionare ogni rack gabbia nella rispettiva camera e chiudere le porte della camera. 5. Condurre un’esposizione Assicurarsi che la valvola per il serbatoio del gas VC sia in posizione aperta. Assicurarsi che il flusso diluente per la camera sperimentale sia impostato su 25 L/min. Avviare il flusso diluente nella camera sperimentale. Assicurarsi che il rotametro sulla camera di controllo sia impostato su 25 L/min. Assicurarsi che tutti i sensori (flussi, temperatura, umidità, pressione della camera, livello di CO2) funzionino correttamente e visualizzino i risultati attesi sia nelle camere sperimentali che in quella di controllo.NOTA: il flusso VC viene calcolato e impostato in base al flusso diluente e alla concentrazione VC desiderata. Assicurarsi che durante l’esposizione, nella camera sperimentale, il tempo di esposizione, il flusso diluente, il flusso VC, la temperatura, l’umidità, la pressione della camera, il livello di CO2 e la concentrazione teorica di VC siano visualizzati, rappresentati graficamente e registrati. Verificare che la temperatura e l’umidità per la camera di controllo siano anche visualizzate, rappresentate graficamente e registrate.NOTA: se si utilizza un sistema manuale, il flusso VC deve essere controllato e regolato, se necessario, per tutto il periodo di esposizione. Se si verificano problemi durante l’esposizione, impostare il flusso VC su zero e aumentare il flusso diluente al suo valore massimo per eliminare rapidamente la camera. Una volta raggiunta la durata dell’esposizione (cioè 6 h/giorno), il software disattiva automaticamente il flusso VC. Il timer di sicurezza di 15 min inizia quindi per il tempo dopo la durata della camera sperimentale per cancellare il VC. Una volta che è sicuro rimuovere gli animali, fare clic sul pulsante OK nella finestra di dialogo. Il sistema interromperà la registrazione delle misurazioni nel file e l’esposizione è finita.NOTA: se si utilizza un sistema manuale, l’utente deve disattivare manualmente il flusso VC alla fine della durata dell’esposizione e deve essere calcolato il tempo per la distanza VC alla fine dell’esposizione. 6. Post-esposizione Ruotare il tappo sulla valvola per il serbatoio del gas VC in posizione chiusa e disattivare tutti i flussi d’aria nella camera di esposizione. Ruotare il rotametro fino a quando nessun flusso d’aria scorre attraverso la camera di controllo. Rimuovere le porte da ogni camera per fornire ventilazione ai topi. Rimuovere i rack della gabbia dalle camere. Sotto un cappuccio, rimuovere i topi dalle gabbie di esposizione e rimetterli nelle loro gabbie di alloggiamento. Trasportare tutti i topi nella loro stanza di alloggio per alloggiare durante la notte in gabbie regolari. Smaltire i rifiuti dell’escreto in un contenitore per rischi biologici approvato dal Dipartimento per la Salute e sicurezza Ambientale (DEHS), in quanto questi possono essere considerati un pericolo chimico dai servizi sanitari ambientali istituzionali. Pulire le porte della camera, la padella degli escrementi, il rack della gabbia di esposizione e la camera di esposizione per i sistemi sperimentali e di controllo. 7. Convalida della concentrazione di VC all’interno delle camere durante l’esposizione Eseguire una misurazione della concentrazione di VC all’interno della camera sperimentale a metà dell’esposizione (3 h). Rompere le punte di vetro su un tubo del rivelatore VC e un tubo di pretrattamento. Fissare l’estremità di flusso del tubo del rivelatore VC alla pompa del tubo del rivelatore. Fissare l’estremità di flusso del tubo del rivelatore VC all’estremità di flusso del tubo di pretrattamento con un breve pezzo di tubo. Fissare un breve pezzo di tubo all’estremità flow-in del tubo di pretrattamento. Rimuovere una spina da una delle porte di campionamento che si trova vicino alla zona di respirazione dei topi. Fissare il tubo dall’estremità di flusso del tubo di pretrattamento alla porta di campionamento. Dal pieno in posizione, estendere la maniglia sul pistone della pompa del tubo del rivelatore fino alla posizione di piena uscita. Questo tirerà 100 mL di gas campionato dalla camera nel tubo del rivelatore VC per un periodo di 90 s. Dopo aver aspettato i 90 s, spingere la maniglia indietro. Ripetere il passaggio 7.4 altre tre volte in modo che un totale di 400 mL venga tirato nel tubo del rilevatore VC. Rimuovere il tubo dal porta di campionamento della camera e reinserire la spina nel porto. Ispezionare il cambio di colore del tubo del rivelatore VC per accertare la concentrazione di VC all’interno della camera. Registrare la lettura del tubo del rilevatore VC nel taccuino di laboratorio e confrontarla con il valore teorico. Smaltire il tubo del rivelatore VC e pretrattare il tubo in un contenitore adatto. 8. Termine dell’esperimento di esposizione all’inalazione NOTA: dopo il timepoint di esposizione desiderato, ad esempio, 6, 8 e/o 12 settimane dopo l’inizio dell’esposizione all’inalazione, gli esperimenti vengono terminati e gli animali saranno sottoposti a eutanasia (vedere la figura 1 per la sequenza temporale). Velocei i topi 4 h prima del tempo di eutanasia.NOTA: Questa procedura consente la determinazione dei livelli di glucosio nel sangue e insulina a digiuno per l’analisi metabolica. Utilizzare un approccio eutanasia coerente con le linee guida dell’American Veterinary Medical Association (AVMA), come l’anestesia seguita da essanguinazione. Somministrare la chetamina/xilanina (100/15 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale a ciascun topo per indurre l’anestesia.NOTA: Evitare il pentobarbital di sodio come anestetico pre-eutanasia, poiché l’esposizione al cloruro di vinile può ostacolarne l’efficacia. Raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore in soluzione di citrato di sodio (finale, 0,38%), per prevenire la coagulazione del sangue e per la conservazione dei campioni. Rimuovere il fegato e/o qualsiasi altro organo desiderato. Dissezionare il fegato e le porzioni di congelamento a scatto in azoto liquido, incorporare nel mezzo campione congelato, e fissare in formalina tamponata 10% per l’istologia. Separare il plasma dal sangue attraverso la centrifugazione e trasferire il plasma citrato in un tubo adatto e conservare a -80 gradi centigradi fino a quando necessario per l’analisi. Per valutare gli indici istologici delle lesioni epatiche, eseguire la colorazione ematossia e eosina (H&E) con 5 sezioni epatiche incorporate a paraffina formalina di 5 M e ottenere immagini con un microscopio a campo luminoso. Per ottenere livelli transaminasi al plasma, eseguire sia l’aminotransferasi alanina (ALT) che i test cinetici AST (AsT) sul plasma citrated utilizzando kit disponibili in commercio.NOTA: per il controllo di qualità, le transaminasi al plasma per i mouse C57Bl/6J devono essere nell’intervallo normale (35-45 IU/L) per il gruppo LFD,VC, mentre i valori devono essere elevati (150 IU/L) per il gruppo HFD-VC (Figura 3C).

Representative Results

Nel corso dell’esperimento, il peso corporeo degli animali e il consumo di cibo sono stati monitorati settimanalmente per garantire la salute degli animali e valutare il metabolismo in vivo. Figura 3A illustra il peso corporeo e il consumo di cibo per un esperimento di 12 settimane. Il peso corporeo è stato misurato una volta alla settimana e il consumo di cibo è stato misurato due volte alla settimana per tutti i gruppi. Tutti i topi hanno guadagnato peso durante il corso dello studio. Mentre, come previsto, i topi nei gruppi HFD hanno guadagnato più peso come i topi nei gruppi LFD, i topi esposti a VC non hanno guadagnato più peso rispetto ai topi nel rispettivo gruppo di controllo. Il consumo di cibo non era diverso tra tutti i gruppi12,24. Figura 3B raffigura fotomicrografie rappresentative di sezioni epatiche macchiate con H&E per l’analisi della morfologia generale. Nel gruppo LFD, VC non ha causato modifiche patologiche palesi. L’alimentazione dell’HFD ha aumentato significativamente la steatosi (accumulo di grasso) e l’esposizione al VC ha aumentato questo effetto. Inoltre, l’esposizione al VC nel gruppo HFD ha provocato alcuni foci infiammatori12,24. I livelli di transaminasi al plasma (ALT e AST) sono stati misurati come indicatori di danno epatico e un livello di transaminasi elevato è un indicatore di danni al fegato. Nel gruppo LFD, VC non ha aumentato i livelli transaminasi. HFD da solo leggermente aumentato livelli di transaminasi e, soprattutto, VC notevolmente migliorato questo effetto (Figura 3C)12,24. Peso del fegato a i rapporti di peso corporeo sono stati calcolati per ogni gruppo. HFD significativamente aumentato il fegato a peso corporeo rapporti. Tuttavia, VC non ha aumentato significativamente questo effetto (Figura 3D)12. Figura 1: Panoramica della procedura del modello di inalazione. I topi sono alimentati le rispettive diete a basso contenuto di grassi saturi (13%) o ad alto contenuto di grassi saturi (42% di grassi saturi) ad libitum per 1 settimana per acclimatarli alla dieta purificata. Dopo una settimana, i topi vengono introdotti al regime di inalazione. A tale scopo, i topi sono collocati in camere di inalazione dell’intero corpo all’avanguardia per l’esposizione a una concentrazione VC di livello OSHA inferiore a <1 ppm (0,85 ppm – 0,1 ppm) o aria ambiente (controllo) per 6 ore al giorno, 5 giorni/settimana, per 12 settimane. Durante la procedura di inalazione ai topi è consentito l'accesso gratuito al cibo e all'acqua. A 12 settimane, i topi sono eutanasia al mattino. Questo modello può essere esteso a periodi più lunghi di esposizione cronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Progettazione della camera di inalazione. Viene mostrato un diagramma di un sistema automatico di esposizione all’inalazione che fornisce concentrazioni tossiche omogenee. Il software personalizzato consente all’utente di modificare, monitorare e registrare le variabili ambientali durante le esposizioni all’inalazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Cloruro di vinile da solo non causa lesioni al fegato overt, ma migliora la malattia epatica indotta dalla dieta. (A) Il peso corporeo e il consumo alimentare sono stati monitorati settimanalmente. (B) Sono mostrati fotomicrografi epatici rappresentativi della morfologia generale del fegato mediante colorazione H&E (ingrandimento n. 200x). (C) Il plasma citrato è stato raccolto alla fine del periodo di esposizione e analizzato per l’attività ezimatica transaminase come indice dei danni al fegato. (D) Il peso del fegato è stato determinato in diversi momenti sperimentali e confrontato con il peso corporeo. I risultati sono presentati come media : SEM.a, p < 0,05 rispetto al rispettivo controllo LFD; b, p < 0,05 rispetto all'assenza di VC. Dimensione dei campioni per gruppo n : 8-10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo modello di NAFLD potenziato da VC è un nuovo metodo per valutare l’effetto dell’esposizione vc del limite sub-OSHA in un paradigma di inalazione per tutto il corpo. Questo modello consente agli sperimentatori di studiare gli effetti sub-epatotossici e sensibilizzanti da bassi livelli di VC da solo. Infatti, questo modello di co-esposizione raggiunge una maggiore lesione epatica, elevazione del plasma ALT e AST e infiammazione moderata, mentre in gran parte non colpisce altri sistemi di organi, come il cuore, a questa concentrazione23. Questo modello cronico richiede camere di inalazione per tutto il corpo, ma riduce al minimo le concentrazioni di stress ed esposizione. Anche se il protocollo qui presentato è un approccio basato sul software, la nostra esperienza ha dimostrato che l’approccio manuale è anche un metodo accurato e coerente di esposizione12,24. Inoltre, è facilmente applicabile a più aree di ricerca tra cui altri danni agli organi23 causati da esposizione volatile composto organico22. In particolare, questo modello può assomigliare più da vicino alla patogenesi delle co-esposizioni umane alle sostanze chimiche ambientali e alle malattie sottostanti5.

Per ottenere risultati simili, è necessario ottenere alcuni passaggi critici dell’ottimizzazione del protocollo. Ad esempio, gli investigatori devono stabilire che la concentrazione di VC o di altri sostanze tossiche all’interno delle camere rientra nell’intervallo di esposizione desiderato (ad esempio, basso livello, sub-OSHA o livelli acuti). Ottimizzare questa fase della camera di inalazione è fondamentale per un modello di successo dell’esposizione umana di interesse. In secondo luogo, è possibile modificare anche il tempo di esposizione al giorno e la durata dell’esperimento. Per gli interessi di questo gruppo, è stato raggiunto un ambiente di esposizione professionale, ed è stato studiato anche un ulteriore parametro di dieta. Tuttavia, anche le esposizioni ambientali e acute possono essere modellate con questo protocollo.

Questo lavoro mette in discussione il paradigma che gli attuali limiti di esposizione di VC (occupazionale e ambientale) sono sicuri. Infatti, anche se l’attuale limite di esposizione OSHA per VC è di 1 ppm, questo modello ha dimostrato che le concentrazioni di VC al di sotto di questo limite sono sufficienti per migliorare le lesioni epatiche causate dall’HFD nei topi. Questo protocollo consente agli investigatori di studiare e caratterizzare un nuovo paradigma di esposizione tossica e di modellare TASH.

Questo è il primo modello di esposizione cronica a basso dosaggio VC. I lavori precedenti hanno utilizzato concentrazioni molto elevate di bolus, esposizioni acute o metaboliti attivi come surrogati per l’esposizione al VC. Tutti questi approcci riducono la rilevanza dei risultati per l’esposizione umana. Pertanto, questo nuovo modello di interazione TASH-NAFLD fornisce la piattaforma necessaria per i ricercatori per esaminare complesse interazioni di esposizione VC di basso livello.

Questo modello di lesione epatica indotta da tossico può essere utilizzato per altri composti organici volatili e anche per studiare altre interazioni che possono avere un impatto sul fegato e altri sistemi di organi8,22,23. Inoltre, questo modello è stato, e può essere ulteriormente, utilizzato per studiare terapie di intervento e studi meccanicistici approfonditi della modalità di azione per questo tossico prevalente24. Poiché VC è un noto cancerogeno26,27,28, questo paradigma di esposizione può essere modificato anche per lo studio del cancro indotto da VC. Altre co-morbidità come la malattia epatica alcolica possono anche essere potenziate dalla co-esposizione di VC. Inoltre, sarebbe interessante studiare diversi tipi di grassi, come il grasso polinsaturi18,29,30o diversi tipi di carboidrati31 e la loro co-esposizione con VC in questo modello. Infatti, tutti questi fattori sono noti per avere effetti differenziali sullo sviluppo di lesioni epatiche e possono svolgere un ruolo nella malattia epatica indotta da VC.

In conclusione, si tratta di un nuovo modello di inalazione di lesioni epatiche indotte da tossicodipendenza ambientale e stabilisce un paradigma di esposizione per l’esposizione cronica a VC di basso livello. La concentrazione di VC utilizzato in questo modello è sub-epatossica da sola, mentre migliora la lesione epatica causata da un altro fattore (HFD) nei topi. Questo modello permetterà agli sperimentatori di studiare meccanismi e interventi per la tossicità cronica del VC e può essere utile per studi traslazionali che esaminano soggetti umani esposti e con il più alto rischio di esposizione.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato dai premi dei National Institutes of Health (K01 DK096042 e R03 DK107912) a Juliane Beier. La ricerca è stata sostenuta anche da un Institutional Development Award (IDeA) dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di sovvenzione P20GM11326 e dall’Istituto Nazionale per l’abuso di alcol e l’alcolismo del Istituti Nazionali di Sanità sotto il premio Numero P50AA024337. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.

Materials

ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution
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References

  1. Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
  2. ATSDR. . Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
  3. Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
  4. Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
  5. Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J., Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer’s Hepatology. , 476-492 (2012).
  6. Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
  7. EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
  8. Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
  9. Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
  10. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  11. Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease – A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
  12. Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
  13. Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
  14. Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
  15. Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
  16. Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. 生物化学. 18 (23), 5177-5182 (1979).
  17. Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
  18. Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
  19. Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. 癌症研究. 62 (2), 5183-5188 (2002).
  20. Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
  21. Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
  22. Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
  23. Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
  24. Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
  25. Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
  26. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , (2008).
  27. IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, 9 (2012).
  28. Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
  29. Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
  30. Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
  31. Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).
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