ויניל כלוריד ודיאטה גבוהה-שומן כמודל לסביבה ואינטראקציה השמנת יתר
Summary
המטרה של פרוטוקול זה הייתה לפתח מודל מוראי של חשיפה לרעילות ברמה נמוכה, שאינה גורמת לפגיעה בכבד הגלויה אלא מקשה על נזקי הכבד הקיימים מראש. פרדיגמה זו מעדיפה על חשיפת החשיפה האנושית ועל השינויים העדינים המתרחשים בחשיפה לריכוזי הרעילות הנחשבים לבטוחים.
Abstract
ויניל כלוריד (VC), זיהום סביבתי שופע, גורם steatohepatitis ברמות גבוהות, אבל נחשב בטוח ברמות נמוכות. למרות שמספר מחקרים חקרו את התפקיד של vc כהפרוקסינט ישיר, המושג vc משנה רגישות של הכבד לגורמים אחרים, כגון מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (nafld) הנגרמת על ידי דיאטה גבוהה שומן (hfd) הוא רומן. פרוטוקול זה מתאר פרדיגמה של חשיפה להערכת ההשפעות של חשיפה כרונית ברמה נמוכה ל-VC. עכברים מתחילים להתרגל לדיאטה דל שומן או שומן גבוה שבוע לפני תחילת חשיפת האינהלציה ונשארים בדיאטות הללו לאורך כל הניסוי. עכברים חשופים ל-VC (רמת האושה: < 1 עמודים לדקה) או אוויר בתאי האינהלציה במשך 6 שעות ביום, 5 ימים בשבוע, עד 12 שבועות. בעלי חיים הם תחת פיקוח שבועי לעלייה במשקל הגוף ואת צריכת המזון. מודל זה של חשיפה VC אינו גורם לפגיעה בכבד באמצעות VC בלבד. עם זאת, השילוב של VC ו-HFD מגביר באופן משמעותי את מחלת הכבד. יתרון טכני של מודל זה שיתוף חשיפה היא חשיפה לכל הגוף, ללא איפוק. יתר על כן, התנאים דומים יותר למצב האנושי נפוץ מאוד של חשיפה משולבת VC עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי הבסיסית ולכן לתמוך השערת הרומן כי VC היא גורם סיכון סביבתי להתפתחות של נזק בכבד כסיבוך של השמנת יתר (כלומר, nafld). עבודה זו מאתגר את הפרדיגמה שמגבלות החשיפה הנוכחיות של VC (תעסוקתיות וסביבתיות) בטוחות. השימוש במודל זה יכול לשפוך אור חדש ולדאוג לסיכונים בחשיפה של VC. מודל זה של פגיעה בכבד הנגרמת על ידי הרעילות ניתן להשתמש עבור תרכובות אורגניות נדיפים אחרים כדי ללמוד אינטראקציות אחרות שעלולות להשפיע על הכבד ומערכות איברים אחרים.
Introduction
מספר רב של רעלים נמצאים באוויר שאנו נושמים ברמות נמוכות מאוד. ויניל כלוריד (VC) הוא גז monomeric המשמש בתעשייה כדי ליצור פוליוויניל כלוריד (PVC) מוצרים פלסטיים1. מדובר בטיפול סביבתי שכיח, מסרטן ידוע, והוא מדורג #4 ב-ATSDR עדיפות חומר מסוכן2. כדי להבין טוב יותר את ההשפעות הרעילות על בריאות האדם ואינטראקציות עם שיתוף הmorbidities הקיים, הקמת מודלים של חשיפה לחקות את החשיפה האנושית היא קריטית. האינטרס העיקרי של הקבוצה היא ללמוד את ההשפעות הכבד של החשיפה VC כרונית בריכוזים נמוכים. VC מפעילה את ההשפעות העיקריות שלה על הכבד, איפה זה הוכח (בריכוזים גבוהים) כדי לגרום סטרומטוזיס, ואת הרעילות הקשורים steatoצהבת (טאש) עם נמק, פיברוזיס, שחמת3,4, כמו גם קרצינומה של hepatocellular (HCC) ואת הכבד מאוד נדירים hemangiosarcoma5. כנראה שטאש קיימת באוכלוסיה במשך עשורים, אך נותרה בלתי מאופיינת ומוערכת בידיהחוקרים 4,6. כתוצאה ממחקר הממחיש חששות הרעילות ישירה לחשיפה VC, מינהל בטיחות תעסוקתית ובריאות (האושה) הוריד את סף החשיפה המקובל ל 1 דפים לדקה על יום עבודה של 8 h7. למרות שהסף של החשיפה הופחת, ההשפעה של ריכוז זה של VC בבריאות האדם אינה ברורה7. בנוסף, ההשפעה של חשיפת ההון העצמי על מחלות המין הקיים, כגון מחלת כבד, היא ברובה לא ידועה8. פער הידע הזה חשוב במיוחד כיום בשל השכיחות העולמית הגוברת של מחלת כבד שומני שאינם אלכוהוליים (נלfd)4,6,7,9,10,11,12. חשוב מכך, VC הוכח לאחרונה כגורם סיכון עצמאי למחלת הכבד מסיבות אחרות13. לפיכך, המטרה של פרוטוקול זה הייתה לפתח מודל אינהלציה רלוונטי לחשיפה לרעילות הסביבה הנדיף, VC בהקשר של פגיעה בכבד הבסיסית, לחקות את החשיפה האנושית ולזהות פוטנציאל, מנגנונים חדשניים של פגיעה בכבד מסוג VC או מוגברת של הון.
הדרך העיקרית לחשיפה לרעלים סביבתיים ומזהמים רבים היא באמצעות אינהלציה. ברגע שנשאף, המתחם יכול להיכנס מחזור מערכתית דרך הריאות, לנסוע אל הכבד, ולהיות metabolically מופעל על ידי אנזימים בכבד לפני מופרשים14,15,16. לעתים קרובות אלה מטבוליטים פעילים הגורמות רעילות ונזק בתוך הגוף. המחקרים הקודמים על ידי קבוצה זו ואחרים השתמשו VC מטבוליטים כמו מחליפים לחשיפה גז VC17,18. קבוצות אחרות השתמשו בדגמי אינהלציה של VC; עם זאת, רמות חשיפה גבוהה מאוד (> 50 עמודים לדקה) יושמו כדי לגרום לרעילות חריפה, פציעה חמורה בכבד, ופיתוח הגידול19. למרות שמחקרים אלה סיפקו מידע חיוני ומנגנונים של מסרטנים המושרה על ידי VC, הם אינם מקבלים את ההשפעות העדינות ואת האינטראקציות המורכבות עם גורמים תורמים אחרים ולכן הם פחות רלוונטיים לחשיפה אנושית.
בנוסף, מודל ה-VC בתוספת דיאטת שומן גבוהה (HFD) המתואר כאן (ראה איור 1 לציר הזמן), הוא הדגם הראשון של חשיפה של VC כרונית, במינון נמוך (כלומר, ריכוז תת-שוואושה), בו העכברים חשופים לרעילות בתנאים המחקים את החשיפה האנושית הרבה יותר. אכן, נתונים ממודל זה לאחר מכן התוצאות נצפו בבני אדם חשופים VC, כגון ההשפעה על מסלולים מטבולית20, לחץ חמצוני ותפקוד מיטוכונדריאלי4. מודלים אחרים של שאיפת עכבר, כגון מודלים לראש בלבד ולאף בלבד21, דורשים שהחיה תהיה מאופקת, ותגרום למתח בפני החיה. כאן, שיטת החשיפה לגוף כולו אינה דורשת הזרקה או הדחק לבעלי חיים. בעלי החיים מגישים גישה למזון ולמים, והם ממוקמים בתוך חדר האינהלציה הגדול יותר למשך מספר שעות קבוע ביום ובימים בשבוע. יתר על כן, המושג כי VC משנה את הרגישות לעוד האסכולה החדשה הוא ממצא הרומן, הפגינו לראשונה על ידי קבוצה זו12 ויש לו השלכות על חשיפה VC בריכוזים היטב מתחת לאלה הדרושים עבור המופילתחקסיטי הישיר.
שיטה זו של חשיפה לאינהלציה יכולה לשמש כדי לחקות חשיפה למגוון של רעלים גזי גז, כולל תרכובות אורגניות נדיפות אחרות, הקיימות בסביבה שלנו. ואכן, תרכובות אורגניות נדיף הן קבוצה גדולה של הרעלים הסביבתיים ושכיחה יותר באזורים מתועשת, וכתוצאה מכך אוכלוסיות מסוימות להיות בסיכון גבוה יותר לחשיפה כרונית22. ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי להתאים שאלות נסיוניות שונות. משך הזמן והריכוז של המנוהל מורכבים יכול להיות מגוון. למרות שפותחה בתחילה לקביעת פציעה בכבד, מערכות איברים אחרים יכולים ונחקרו עם מודל זה23. חוקרים המבקשים ללמוד חשיפות כרוניות עם בעלי חיים, אך רוצים למזער את הלחץ בעלי חיים, צריכים לשקול שימוש במודל זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל זה של שיטת משופרת-NAFLD היא שיטה הרומן כדי להעריך את ההשפעה של מגבלת משנה את החשיפה VC בפרדיגמת שאיפת גוף שלם. מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד את ההשפעות התת-הפאטוקסיות והרגישות של רמות נמוכות של VC לבד. אכן, מודל זה שיתוף חשיפה משיגה פציעה בכבד משופרת, העלאת הפלזמה ALT ו-AST ודלקת מתונה, בעוד בעיקר לא להשפיע על מערכות איברים אחרים, כגון לב, בריכוז זה23. המודל הכרוני הזה דורש תאי שאיפת גוף שלמים, אך ממזער מתח וריכוזי חשיפה. למרות שהפרוטוקול המוצג כאן הוא גישה מבוססת תוכנה, הניסיון שלנו הראה כי הגישה הידנית היא גם שיטה מדויקת ועקבית של חשיפה12,24. כמו-כן, היא ישימה בקלות לתחומים מחקריים מרובים, כולל נזק איברים אחרים23 הנגרמים על ידי חשיפה אורגנית נדיף התרכובת22. בעיקר, מודל זה עשוי להיות דומה יותר הפתוגנזה של האדם החשיפה האנושית לכימיקלים סביבתיים ומחלה הבסיסית5.
על מנת לקבל תוצאות דומות, יש להשיג שלבים קריטיים מסוימים של מיטוב פרוטוקולים. לדוגמה, על החוקרים לקבוע כי הריכוז של הווייטקונג או הרעילות האחרת בתוך התאים הוא בטווח החשיפה הרצוי (כלומר, רמה נמוכה, תת-שאושה או רמות אקוטי). מיטוב שלב זה של תא האינהלציה חיוני למודל מוצלח של חשיפת האינטרסים האנושיים. שנית, התאמת זמן החשיפה ליום ומשך הניסוי עשוי להיות גם שונה. לפי האינטרס של קבוצה זו, הושגה הגדרת חשיפה תעסוקתית, ומערך נוסף של דיאטה נחקר גם הוא. עם זאת, החשיפות הסביבתיות והחדות עשויות גם להיות מעוצב באמצעות פרוטוקול זה.
עבודה זו מאתגר את הפרדיגמה שמגבלות החשיפה הנוכחיות של VC (תעסוקתיות וסביבתיות) בטוחות. אכן, למרות שמגבלת החשיפה הנוכחית של VC היא 1 עמודים לדקה, מודל זה הוכיח כי ריכוזי VC מתחת למגבלה זו מספיקים כדי לשפר את פגיעה בכבד הנגרמת על ידי HFD בעכברים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללמוד ולאפיין את הפרדיגמה החדשנית של חשיפת הרעילות ולדגם טאש.
זהו הדגם הראשון של חשיפה כרונית, במינון נמוך של VC. העבודה הקודמת בשימוש ריכוזי ההזנה גבוהה מאוד, חשיפות חריפה או מטבוליטים פעילים כתחליפים עבור חשיפה VC. כל הגישות הללו מפחיתים את הרלוונטיות של הממצאים לחשיפה אנושית. לכן, מודל הרומן של האינטראקציה של טאש-NAFLD מספק את הפלטפורמה הנחוצה לחוקרים לבחון אינטראקציות מורכבות של חשיפה של VC ברמה נמוכה.
מודל זה של פגיעה בכבד המושרה הרעילות יכול לשמש עבור תרכובות אורגניות נדיפים אחרים גם כדי ללמוד אינטראקציות אחרות שעלולות להשפיע על הכבד ומערכות איברים אחרים8,22,23. יתר על כן, מודל זה כבר, והוא יכול להיות נוסף, משמש לחקור טיפולי התערבות ומחקרים מעמיקים לעומק של מצב פעולה עבור הרעילות הנפוצה הזאת24. כמו VC הוא מסרטן ידוע26,27,28, זה הפרדיגמה חשיפה יכול להיות גם שונה למחקר של סרטן המושרה VC. שיתוף morbidities אחרים כמו מחלת כבד אלכוהוליים עשוי גם להיות משופר על-ידי שיתוף החשיפה VC. בנוסף, זה יהיה עניין ללמוד סוגים שונים של שומן, כגון שומן רב בלתי רווי18,29,30, או סוגים שונים של פחמימות31 ואת החשיפה שלהם עם VC במודל זה. אכן, כל הגורמים הללו ידועים יש השפעות דיפרנציאליות על התפתחות של פציעה בכבד עשוי לשחק תפקיד במחלת הכבד VC המושרה.
לסיכום, זהו מודל אינהלציה הרומן של נזקי הכבד הנגרמת על-ידי הזיהום הסביבתי ויוצר פרדיגמה חשיפה לחשיפה כרונית, ברמה נמוכה של VC. הריכוז של VC בשימוש במודל זה הוא sub-hepatotoxic בפני עצמו, בעוד היא מגבירה את פגיעת הכבד הנגרמת על ידי גורם אחר (HFD) בעכברים. מודל זה יאפשר לחוקרים לחקור מנגנונים והתערבויות של רעילות VC כרונית והוא עשוי להועיל למחקרים טרנסלטיזם התבוננות בנושאים אנושיים חשופים בסיכון הגבוה ביותר לחשיפה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי פרסים מן המכונים הלאומיים לבריאות (K01 DK096042 ו R03 DK107912) כדי Juliane Beier. מחקרים נתמכים גם על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר P20GM113226 והמכון הלאומי על אלכוהול התעללות ו אלכוהוליזם של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר P50AA024337. התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. . Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al. Toxicant-associated steatohepatitis. Toxicologic Pathology. 41 (2), 343-360 (2013).
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J., Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer’s Hepatology. , 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease – A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. 生物化学. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. 癌症研究. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
