פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.
הצורה של חיידק חשוב עבור הפיזיולוגיה שלו. היבטים רבים של פיזיולוגיה התא, כגון תנועתיות תאים, מקדם, וייצור ביוilm יכולים להיות מושפעים מצורת התא. התאים חיידקי תלת מימדי (3D) אובייקטים, למרות שהם מטופלים לעתים נדירות ככאלה. רוב טכניקות המיקרוסקופיה כתוצאה מתמונות דו ממדיות (דו-ממדיות) המובילות לאובדן נתונים הנוגעים לצורה בפועל של תא תלת-ממדי ולוקליזציה של חלבונים. פרמטרי צורה מסוימים, כגון עקמומיות גאוסיאנית (התוצר של שני העקמומיות הראשיים), ניתנים למדידה רק ב-3D מכיוון שתמונות דו-ממדיות אינן מדידת שני העקמומיות הראשי. בנוסף, לא כל התאים משקרים כאשר הדמיה דו-ממדית של תאים מעוקלים עשויה שלא לייצג במדויק את הצורות של תאים אלה. מדידת מדויק לוקליזציה של חלבון ב-3D יכול לעזור לקבוע את הרגולציה המרחבית ותפקוד של חלבונים. טכניקה קונבולוציה קדימה פותחה המשתמשת טשטוש פונקציה של המיקרוסקופ לשחזר צורות 3D תא ו להתאים במדויק חלבונים. כאן, פרוטוקול עבור הכנת והרכבה דגימות עבור הדמיה של תאים חיים של חיידקים ב-3D הן לשחזר צורה מדויקת התא וכדי להתאים את החלבונים מתוארים. השיטה מבוססת על הכנה לדוגמה פשוטה, רכישת תמונת פלורסנט ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB. מיקרוסקופים פלורסנט רבים באיכות גבוהה ניתן לשנות פשוט כדי לקחת את המידות האלה. שחזורים אלה של התא הם אינטנסיביים מבחינה חישובית וגישה למשאבים חישוביים בעלי תפוקה גבוהה מומלצת, למרות שאין צורך בכך. שיטה זו חלה בהצלחה על מינים חיידקיים מרובים מוטציות, שיטות דימות פלורסנט, ויצרני מיקרוסקופ.
תאים מכל הסוגים מסדירים את הצורות שלהם עבור פונקציות ספציפיות. לדוגמה, נוירונים הם בצורת שונה מאשר תאי דם יש פונקציות שונות. באופן דומה, תאים חיידקיים מגיעים במגוון של צורות וגדלים, למרות המטרה של צורות אלה לא תמיד ידוע1,2. לכן, חשוב כי הצורה של תאים חיידקיים ייקבעו במדויק. השיטה שמתוארים בה מציגה דרך מיושמת בקלות לאיסוף נתונים המתאימים לניתוח תלת-ממדי של תאי החיידקים החיים או הקבועים ביותר.
השיטה המתוארת מאפשרת לאחד לקחת תמונות תלת-ממד של תאים חיידקיים כדי לייצג במדויק את צורת התא 3D של המדגם להתאים במדויק חלבונים בתוך צורות אלה. טכניקות מיקרוסקופ מסורתיות לקחת תמונות דו-ממדיות, אשר הוא בעייתי כאשר לומדים תאים בעלי צורות חריגות או לא סימטרי, כגון מוטציות של es,או חיידקים מעוקל כגון vibrio החאריאווים הליקובקטר . בסדר, פילורי בעוד שתמונות תלת-ממד ברזולוציה גבוהה הן הקלט העיקרי לשיטה זו, השיטה אינה מחזירה תמונה משופרת ברזולוציה. במקום זאת, שיטה זו משנה את הקואורדינטות של פני השטח התלת-ממדית ואת צורת התא תוך שימוש באלגוריתם קונבולוציה קדמי תוך שימוש בקווי מחשוב פעילים והפונקציה המטשטוש לכאורה של המיקרוסקופ3 (איור 1). הוא שימש לחקר הומוטין החיידקי של מורד ב -E. coli4,5,6,7, הרומן periskeletal האלמנט החדש ב -V. המרה8, ואת הפום bactofilin CcmA ב הליקובקטר פילורי9 (איור 2).
הלוקליזציה של חלבונים יכול לספק תובנה פונקציות שלהם. לדוגמה, חלבונים המעורבים בחלוקת תאים מותאמים בדרך כלל ל-midcell10,11. מחקרים בתפוקה גבוהה נעשו כדי להתאים את כל החלבונים של חיידק בתקווה לצבור תובנה לתוך הפונקציות שלהם12. למרבה הצער, מחקרים אלה נערכו עם הדמיה דו-ממדית ו-1D או 2D ניתוח, מה שהופך את זה בלתי אפשרי למדוד היבטים ספציפיים של לוקליזציה חלבונים, כמו לוקליזציה לתכונות גיאומטריות סלולר.
לדוגמה, מרבי, חלבון דינאמי הנדרש לצורת מוט של חיידקים רבים, הוא מיפותזה לעבודה על-ידי הנחיית הלוקליזציה של סינתזה של קיר התא, והלוקליזציה שלה מראות את הלוקליזציה של הקיר התאים סינתזה7,13. מרבי ממינים מרובים מציג העשרה גיאומטריים4,6,7,14,15. פולימרים משטח דינמי, כגון MreB, יכול לזוג את הגיאומטריה של פני השטח עד הזמן העשרה בממוצע פרופיל16 ויכול להיות מסוגל לכוון את הגיאומטריות הספציפיות על ידי מזעור האנרגיה הקשורה בכריכה לקרום17. בעוד שחשיבותה של הפיתול, הכיפוף, הכפיית והדינמיקה לא נפתרה לחלוטין עבור MreB, חשוב לציין כי מדידות מדויקות של שני עקמומיות הראשי של משטח דורשים ייצוג תלת-ממד מלא של התא. לכן, כדי למדוד במדויק ביותר את עקמומיות שאליו חלבונים לוקליזציה, זה מועדף להשתמש 3D, במקום הדמיה דו-ממדית. 3D הדמיה מבטלת את הצורך להעריך מבחינה חישובית אלה עקמומיות אשר לא ניתן למדוד ב-2D, הערכה שעשוי לא להיות מדויק בתאים סימטרי18.
למרות הדמיה דו-ממדית של תאים הוא מהיר יותר ואינו דורש כמו עבודה חישובית הרבה יותר, הדמיה 3D מספק ייצוג מדויק יותר של התא, כמו גם את היכולת למדוד תכונות משטח, כגון עקמומיות, אשר לא ניתן למדוד ב-2D. לכן, כאשר הדמיה תלת-ממדית הופכת להיות שגרתי יותר, תובנות חדשות לצורת תא ולוקליזציה של חלבון יהפכו לאפשריות.
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא רכישת תמונות באיכות גבוהה. כדי לשחזר את התאים כהלכה, חייב להיות טשטוש מספיק מעל ומתחת לתא. לכן, זה הכרחי כי מחסנית z נלקח מכסה מרחק גדול מספיק. מספר הצעדים שננקטו במהלך רכישת התמונה ניתן לכוונן עבור כל זן. לדוגמה, תאי קולי שנמחקו עבור rodz הם רחבים יותר ודורשים צעדים נוספים, ולכן, מרחק גדול יותר, מאשר תאים סוג פראי. אם המדגם הנמצא במהלך רכישת תמונה, השחזור יכול לקבל שגיאות מרכזיות. לכן, חשוב להניח לשקופית להגיע לשיווי משקל תרמי עם המיקרוסקופ לפני הדמיה כדי למנוע סחיפה במהלך רכישת מחסנית z. יש לאפשר התאמה של תאים על-גבי רפידות עם פלואורסצנטית אוטומטי נמוך. רכיבי מדיה, כגון אלה שנמצאו במדיום LB משותף, יש פלואורסצנטית אוטומטי שיכול לגרום לבעיות כאשר מנסים לשחזר את התאים. צפיפות התאים בלוח ההדמיה חשובה מכיוון שתהליך השחזור מבוצע באופן עצמאי בכל תא. תאים מעטים מדי יגדיל את הזמן הדרוש כדי להשיג תמונות של מספר מספיק של תאים, בעוד תאים רבים מדי יגרמו לשדות הדמיה כי הם צפופים מדי כדי לחתוך בקלות תאים בודדים. מכיוון שלא כל התאים משחזרים כראוי, יש לדמות תאים נוספים במהלך שלב הרכישה וכל התפוקות אמורות להיות מוקרן לפני המעבר קדימה עם ניתוח סטטיסטי (איור 3).
רבות מהמגבלות עבור שיטה זו הן טכניות. על המיקרוסקופ לשמש, אחד חייב להיות מטרה שיש לו צמצם מספרי גבוה (בדרך כלל > 1.4), כי זה מאפשר מעקב אופטי בקנה מידה של חיידקים. בנוסף, המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בשלב piezo זה יכול לקחת צעדים קטנים, מדויקים בכיוון z. יתרה מזאת, בעוד שאין צורך בכך, גישה למשאבים חישוביים בעלי תפוקה גבוהה כדי להפעיל את תוכנת ניתוח התמונה מומלצת משום שהיא תקטין את זמן העיבוד לתאים משחזרים.
מגבלה רעיונית אחת לשיטה היא שצירי האנרגיה הנכונים לניפוח החלקות של השחזור ביחס ליחס האות לרעש של התמונות חייבים להיבחר. כדי לאמת מבחר פרמטרים, יש למדוד את הגדלים והצורות של התאים באמצעות שיטות עצמאיות כגון שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) או מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). כהוכחה העיקרון, 3D שחזורים של תאים בוצעו גם על AFM לבדוק z-דיוק (< 50 ננומטר) או על רשת TEM לבדוק xy-דיוק (< 30 ננומטר)3. גישה מקורלציה כזו היא זמן רב ויקר. גישה פשוטה יותר יכולה להיות דגימות סטנדרטיות של התמונה כגון תאים סוג פראי או חרוזים כדוריים 1 יקרומטר. הקוטר והספרוגניות של השחזורים יכולים לשמש כדי להבטיח שהגודל ומאזני האנרגיה המשמשים בשחזור יהיו נכונים.
זו אינה השיטה היחידה המבקשת לחלץ מידע מרחבי ברזולוציה גבוהה מתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מאמרי סקירה רבים מתארים את ההתקדמות האחרונה בתחום המיקרוסקופיה הסופר-מיקרוסקופית24,25. טכניקות לשיפור הרזולוציה, כגון מיקרוסקופ לפירוק הדיסק26, מיקרוסקופ מיקרוסקופיה של דיסקים27, פיקסל שינוי28, ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM)29 מבקשים לשפר את הרזולוציה של ה תמונות שנרכשו על ידי המיקרוסקופ. שיטות אלה אינן מתאימות לגישה המוצגת. לאחרונה שיטה זו הותאמה לאפשר תמונות מבוססות ה-SIM כתשומות9. בעוד שהשיטה הקונבולוציה קדימה חולקת חלק מהתפוקה שלה עם מיקרוסקופ פירוק, יש לו פלט שונה לחלוטין. בעוד שגישות כגון המיקרוסקופיה מנסות לשפר את הרזולוציה של הדימוי, גישה זו אינה יוצרת תמונה אלא שחזור של צורה תא עם דיוק של 50 ננומטר בקירוב. מולקולה בעלת שליטה מיקרוסקופית הפעילה על בסיס דגימות בדלילות, יכולה לספק רמות גבוהות אף יותר של דיוק מרחבי משיטה זו. במקרים רבים, אלה מולקולה בודדת גישות דורשים אופטימיזציה של מבנים פלורסנט והוא יכול לדרוש זמני רכישה ארוכים, מה שהופך אותם קשה לשימוש עם דגימות חי או דינמי. כל אחת מהשיטות הללו מגיעה עם אחת או יותר מהאזהרות ששיטה זו אינה. למשל, את היתרונות שפורסם על ידי ספינינג מיקרוסקופ הדיסק המכונה אינם ישימים monolayers של תאים חיידקיים, שם אין הרבה מחוץ לאור המטוס. יתר על כן, שיטה זו מספקת צינור לרכוש צורות תא מדויק 3D ולוקליזציה חלבונים ללא צורך של כל fluorophores מיוחדות. שיטה זו יש דרישות חומרה מינימליות (כלומר, z piezo, גבוהה NA מטרה) והוא דורש רק עשרות תמונות לכל נקודת זמן, ומאפשר לאחד בקלות לחקור מבנים תלת-ממד דינמי6.
יש כבר מספר גדל והולך של גישות ללמוד את הארגון של תאים חיידקיים במבנים תלת-ממד. אלה כוללים גישות מושגית דומה לזה כי לנצל איכות גבוהה, 3d תמונות פלואורסצנטית30,31,32. גישה זו מחייבת תאים מבודדים היטב ואינה מהווה הנחות פריורי בנוגע לגיאומטריה תאית. עם זאת, כדי לעבור לתוך אגרגטים סלולריים צפוף או ביואילאמים, התאים נחשבים כמו מוט. תצוגה זו ברזולוציה נמוכה עדיין מאפשר לבדוק את סידורי האריזה של התאים, למרות הצפיפות הגבוהה של תאים ב-ביוilm מונע ניתוח של הלוקליזציה subcellular של גורמים ספציפיים.
בעתיד, זה עשוי להיות מעניין לפתח מסגרת לשלב את המולקולה היחידה גישות השדה הרחב עם טכניקה זו שחזור תלת-ממד. יתר על כן, ייתכן שניתן לכלול גישה זו קדימה קונבולוציה עם מחשב פילוח כלי הראייה32 כדי לאפשר שחזורים של אשכולות תא צפוף יותר.
מדוע תאים התפתחו לצורות מסוימות היא בעיה מורכבת שחייבת לשקף את הסביבה המורכבת שבה הם חיים. הבנת האבולוציה והתפקוד של צורות התא מחייבת לקחת מדידות מדויקות ומדויקות של צורות אלה, שהיא מה ששיטה זו מספקת.
The authors have nothing to disclose.
אנחנו רוצים להודות לג נגוין וליהושע שווביץ על שעזרו לפתח את השיטה.
מימון: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-גלן מרכזים לחקר הזדקנות הקרן הלאומית למדע PHY-1734030.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |